gpd1基因的農(nóng)桿菌介導轉化萊茵衣藻.pdf

1、目前臨近枯竭的傳統(tǒng)化石燃料及日益惡化的環(huán)境問題，致使生物能源越來越得到廣泛關注，其中藻類生物能源也受到各國科學家的重視。微藻含油量高、生物量高、材料易培養(yǎng)和采收、不占用耕作用地等，可以利用現(xiàn)代生物技術強化微藻脂質代謝途徑、增加微藻的含油量來提高微藻產(chǎn)油的競爭力。其中萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是遺傳背景清晰的真核單細胞藻類，是應用于微藻研究中有關生物燃料研究領域的模式藻，更是研究油脂代謝基因的理想受體藻

2、。
　　甘油-3-磷酸脫氫酶基因（gpd1）可以調(diào)控植物脂質代謝中關鍵酶甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)的活性，能促進植物脂質合成，同樣也決定萊茵衣藻代謝中甘油三酯(TAG)的合成。借助外源gpd1基因提高萊茵衣藻TAG含量，有助于完善萊茵衣藻TAG調(diào)控的相關通路和其脂質積累條件的摸索。研究表明在細胞壁缺陷型微藻中過表達外源gpd1基因可以提高藻細胞的油脂含量，但是所選的細胞壁缺陷型藻株材料造成了gpd1基因的過表達研究的局限性。

3、
　　基于此，本研究通過農(nóng)桿菌介導法在常規(guī)萊茵衣藻（有細胞壁）中過表達gpd1基因，來提高藻細胞油脂含量。實驗中克隆酵母gpd1基因，構建萊茵衣藻的農(nóng)桿菌雙元表達載體pRI-Ble-GPD1，以萊茵衣藻（藻株:FACHB-479）為受體，通過農(nóng)桿菌介導法將gpd1基因轉移到FACHB-479基因組，經(jīng)過篩選培養(yǎng)、PCR及RT-PCR分子生物學鑒定獲得轉基因藻株，其中油脂含量可以增高。所取得的具體研究結果如下:
　　1.優(yōu)化了

4、萊茵衣藻FACHB-479實驗室培養(yǎng)體系:TAP培養(yǎng)基，2000Lx、25±2℃，每天數(shù)次100rpm震蕩5min，培養(yǎng)5d可以達到對數(shù)生長期，且不凝集;進行1∶1000傳代擴大培養(yǎng)，藻細胞生長旺盛。
　　2.本研究構建了適用于應用農(nóng)桿菌介導法轉化萊茵衣藻FACHB-479的帶有外源酵母gpd1基因的雙元表達載體pRI-Ble-GPD1:經(jīng)過酵母gpd1基因的PCR獲得，重組克隆載體pMD-GPD1的構建，重組中間載體pDBle-

5、GPD1的構建，表達載體pRI-Ble-GPD1的構建四步構建出表達載體。之后凍融法轉化到農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞，并通過Amp(100μg/mL)抗性的YEB平板篩選得到陽性LBA4404，可以攜帶外源酵母gpd1基因，用于衣藻的轉化。
　　3.通過農(nóng)桿菌介導法成功轉化萊茵衣藻FACHB-479，獲得轉gpd1基因藻株FACHB-GPD:衣藻載體pRI-Ble-GPD1攜帶gpd1基因，經(jīng)農(nóng)桿菌介導轉化FACHB-479

6、細胞，歷經(jīng)共培養(yǎng)48h，Zeocin(10μg/mL)抗性的TAP固體篩選培養(yǎng)5d，可以收獲到陽性轉化藻;PCR和RT-PCR檢測目標條帶1175bp存在，目的gpd1基因在轉基因FACHB-GPD順利整合和表達。
　　4.優(yōu)化了尼羅紅染色法檢測萊茵衣藻油脂的方法:使用終濃度40mg/L的尼羅紅—甲醇溶液，23℃，避光染色15min，萊茵衣藻細胞中脂滴熒光效果好。
　　5.轉gpd1基因藻FACHB-GPD的油脂含量提高:尼