病毒限制性因子SAMHD1參與DNA損傷修復(fù)反應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:DNA是生命個(gè)體重要的遺傳物質(zhì)，時(shí)刻受到體內(nèi)外有害因素的威脅引起不同程度的DNA損傷，常見的DNA損傷類型包含堿基缺失、堿基對(duì)錯(cuò)配、DNA單鏈斷裂(SSB)和DNA雙鏈斷裂(DSB)。生物個(gè)體在進(jìn)化過程中為了應(yīng)對(duì)DNA損傷形成了一套復(fù)雜而高效的DNA損傷修復(fù)(DNA Damage Response，DDR)機(jī)制[1]，通過細(xì)胞周期阻滯，為修復(fù)損傷的DNA贏得充足的時(shí)間，保證了遺傳信息的正確傳遞，進(jìn)而維持基因組的穩(wěn)定;而DNA損傷嚴(yán)

2、重超出自身修復(fù)能力時(shí)，細(xì)胞將啟動(dòng)自噬、衰老等程序，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而限制基因組的不穩(wěn)定[4]。在人類的多種疾病中已證實(shí)存在DDR缺陷，如神經(jīng)退行性疾病、免疫缺陷、代謝綜合征以及癌癥等[2-4]。綜上，DNA損傷和修復(fù)的復(fù)雜機(jī)制決定細(xì)胞的最終命運(yùn)。
　　細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶2（Cell cycle checkpoint kinase2，Chk2）是DNA損傷修復(fù)應(yīng)答反應(yīng)的關(guān)鍵分子，未發(fā)生DNA損傷時(shí)，Chk2以非活性的單體形式存在

3、于細(xì)胞核中[5];細(xì)胞受到基因毒性作用發(fā)生DNA損傷時(shí)，Chk2被ATM、DNA-PKcs等激活，磷酸化Cdc25C、P53和BRCA1等關(guān)鍵的作用底物，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡[6]等生物學(xué)事件。除了參與DNA損傷修復(fù)反應(yīng)，Chk2在有絲分裂進(jìn)程和染色體穩(wěn)定性的維持中起著重要作用。
　　SAMHD1（Sterile alpha motif and HD-domain containing protein1）最初

4、發(fā)現(xiàn)于人樹突狀細(xì)胞的cDNA文庫，包含SAM結(jié)構(gòu)域和HD結(jié)構(gòu)域。SAM結(jié)構(gòu)域具有蛋白與蛋白或蛋白與核酸之間的相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能;HD結(jié)構(gòu)域是由組氨酸和天冬氨酸組成，主要發(fā)揮磷酸水解酶的活性。SAMHD1作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)的三磷酸水解酶(dNTPase)，可以將細(xì)胞內(nèi)的dNTP水解為核苷酸和三磷酸，該水解酶活性受其蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的調(diào)控，SAMHD1蛋白磷酸化水平越高，其dNTP水解酶活性越低。以往研究顯示，細(xì)胞周期

5、蛋白(Cyclin A2)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK1)可以在蘇氨酸(Thr)592位點(diǎn)磷酸化SAMHD1，從而降低其dNTP水解酶活性，引起細(xì)胞內(nèi)dNTP含量升高，有利于病毒復(fù)制[7-9]。在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及靜息期的CD4+T細(xì)胞（G0/G1期）中，SAMHD1顯著降低細(xì)胞內(nèi)的dNTP水平，使人免疫缺陷病毒(HIV-1)的復(fù)制及感染受限，因而被看做是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的天然免疫蛋白[10,11]。研究發(fā)現(xiàn)，SAMHD1突變與人類

6、自身免疫疾病AGS綜合征（Aicardi-Goutieres syndrome）密切相關(guān)[12,13]，在患者的成纖維細(xì)胞中已檢測(cè)到dNTP水平增加與慢性DNA損傷[14]，研究報(bào)道腺病毒、單純皰疹病毒感染機(jī)體過程中伴隨DNA損傷[15]，揭示了病毒感染與宿主細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)途徑之間存在復(fù)雜的關(guān)系，提示我們SAMHD1可能參與DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。
　　目前已報(bào)道SAMHD1作為一種新型的病毒抑制因子，能強(qiáng)有力的對(duì)抗HIV-1等

7、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染;關(guān)于SAMHD1限制HSV-1等DNA病毒感染的研究較少;在病毒感染與復(fù)制的不同階段，SAMHD1調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)DNA損傷與修復(fù)反應(yīng)的具體機(jī)制尚不清楚。因而，本研究旨在探討天然免疫蛋白SAMHD1是否參與DNA損傷修復(fù)過程;解析SAMHD1參與調(diào)控DNA損傷修復(fù)反應(yīng)的分子機(jī)制;闡明SAMHD1作為DNA損傷修復(fù)反應(yīng)經(jīng)典通路中Chk2的底物，其磷酸化修飾水平對(duì)維系基因組穩(wěn)定性的影響。
　　方法:1.利用Ⅰ型人皰疹病毒

8、(HSV-1)感染人結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116)實(shí)驗(yàn)，研究SAMHD1對(duì)DNA病毒感染的限制作用。2.培養(yǎng)人結(jié)直腸癌(HCT116)細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維(MEF)細(xì)胞，通過Western Blot技術(shù)檢測(cè)應(yīng)激條件下DNA損傷修復(fù)反應(yīng)標(biāo)志性蛋白表達(dá)及SAMHD1蛋白磷酸化水平變化。3.通過慢病毒包裝建立穩(wěn)定沉默SAMHD1的細(xì)胞株、過表達(dá)SAMHD1的細(xì)胞株，檢測(cè)正常培養(yǎng)及應(yīng)激條件下DNA損傷修復(fù)反應(yīng)標(biāo)志性蛋白的改變，觀察SAMHD1表達(dá)

9、水平對(duì)DNA損傷修復(fù)過程的影響。4.運(yùn)用免疫共沉淀方法，檢測(cè)正常培養(yǎng)及應(yīng)激條件下Chk2與SAMHD1的結(jié)合情況和SAMHD1磷酸化水平的改變，進(jìn)一步了解內(nèi)源性Chk2與SAMHD1的相互作用。5.利用核漿分離實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)SAMHD1細(xì)胞定位并觀察SAMHD1與Chk2在細(xì)胞中分布情況。6.在沉默Chk2與過表達(dá)Chk2的人結(jié)直腸癌細(xì)胞、缺失Chk2與正常對(duì)照的乳腺癌細(xì)胞中，檢測(cè)正常培養(yǎng)及應(yīng)激刺激下DNA損傷修復(fù)反應(yīng)標(biāo)志性蛋

10、白的改變。探究Chk2調(diào)控SAMHD1磷酸化水平對(duì)DNA損傷修復(fù)反應(yīng)的影響。
　　結(jié)果:1.在HSV-1感染過程中，SAMHD1發(fā)揮了抗病毒感染的功能。2.SAMHD1參與了細(xì)胞在應(yīng)激條件下誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)生，并且伴隨SAMHD1磷酸化水平的升高。3.在DNA損傷刺激條件下，沉默SAMHD1抑制了細(xì)胞內(nèi)dNTP水解功能，有利于DNA復(fù)制，促進(jìn)了DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。4.Chk2在應(yīng)激條件下與SAMHD1在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，