反相高效液相色譜技術(shù)在生物樣品中D-氨基酸和（R）-鱆胺分析的應(yīng)用研究.pdf

1、手性是自然界的本質(zhì)屬性之一。許多與生命活動密切相關(guān)的氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等具有生物活性的物質(zhì)均具有一個或多個手性中心。由于對稱性和光學(xué)活性的不同，不同對映異構(gòu)體在生命體內(nèi)表現(xiàn)出不同的生理活性，它們在體內(nèi)的分布變化和代謝與某些疾病的形成密切相關(guān)。因此，對映體的分離和測定，在生命科學(xué)及其它相關(guān)領(lǐng)域均具有重要意義。 本文采用柱前衍生化反相高效液相色譜(HPLC)分析技術(shù)，對天冬氨酸（Asp）、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、鱆胺(O

2、A)對映體進(jìn)行了手性拆分研究，建立了生物樣品中D-氨基酸和(R)-OA的測定方法，并已應(yīng)用于小鼠腦組織中D-氨基酸和蜜蜂腦組織中(R)-OA的測定，同時對幾種D-氨基酸與帕金森疾病的相關(guān)性進(jìn)行了初步探討。論文的研究工作主要包括以下三方面： 1．建立了測定生物樣品中微量D-Asp、D-Glu的HPLC法。以鄰苯二甲醛—N-異丁?；?L-半胱氨酸(OPA-IBLC)柱前衍生。醋酸鈉-甲醇-乙腈混合液為流動相，采用梯度淋洗技術(shù)，2種氨

3、基酸對映體在40 min內(nèi)完全分離。以熒光檢測，D-Asp、D-Glu的濃度在10～1000 nmol/L時，其濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，當(dāng)信噪比為3（S/N=3）時，D-Asp和D-Glu的檢出限分別為2.0 nmol/L、1.0 nmol/L 。首次對帕金森疾病(PD)模型小鼠中腦D-Asp和D-Glu含量變化進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組與模型組中腦D-Asp含量無顯著性差異，而D-Glu 含量呈現(xiàn)顯著性差異。推測在中腦組織里，內(nèi)源

4、性的D-Asp的合成及轉(zhuǎn)運不受神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)的毒害仍保持原有的動態(tài)平衡，而D-Glu可能具備與L型對映體相似的興奮毒性，參與PD的發(fā)病機(jī)制。 2．采用鄰苯二甲醛—N-異丁?；?D-半胱氨酸(OPA-IBDC)為手性衍生試劑，甲醇-乙腈-醋酸鈉混合液為流動相，在C18柱上拆分了D.L-Ser對映體。分別考察了流動相組成、流速和柱溫等對分離的影響，確立了最佳分離條件，其分離度達(dá)到2.

5、74。D-Ser濃度在30～6000 nmol/L范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系。將方法運用于PD模型小鼠中腦及大腦皮質(zhì)中D-Ser含量的測定，結(jié)果表明，模型組腦組織中D-Ser的含量與對照組相比，整體呈明顯下降趨勢，推測D-Ser可能參與了PD的病理生理過程。 3．建立了一種適合蜜蜂腦組織中(R)-OA測定的方法。以鄰苯二甲醛—N-乙酰基-半胱氨酸(OPA-NAC)為手性衍生試劑，采用HPLC技術(shù)，對OA對映體衍生物的手性分離