牦牛腦AQP9的功能特征.pdf

1、缺氧是許多重大疾病尤其是腦疾病發(fā)生發(fā)展的主要誘因。近年來，青藏高原動(dòng)物對(duì)其極端低氧生境適應(yīng)的生理和遺傳機(jī)制已受到廣大學(xué)者的高度關(guān)注。牦牛是對(duì)青藏高原高寒、低氧、枯草期等極端生境適應(yīng)的唯一大型哺乳動(dòng)物（海拔4,000m以上）。水通道蛋白9（AQP9）作為“神經(jīng)元通道”，其不僅參與腦細(xì)胞水和能量底物（甘油、尿素、腺嘌呤、尿嘧啶、乳酸和β-羥基丁酸）的轉(zhuǎn)運(yùn)，且還參與p53調(diào)控相關(guān)的細(xì)胞凋亡和能量代謝。但到目前為止，尚未見到任何有關(guān)牦牛腦AQP

2、9適應(yīng)低氧功能特征的研究報(bào)道。因此，為了探究青藏高原動(dòng)物對(duì)其極端低氧生境適應(yīng)的分子機(jī)制，本論文以牦牛腦作為研究對(duì)象，AQP9的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及其功能特征為突破口，運(yùn)用基因克隆、載體構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、基因過表達(dá)、原位雜交、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光及Westernblotting等技術(shù)，系統(tǒng)分析了牦牛腦AQP9對(duì)其極端低氧生境適應(yīng)的功能特征。
　　結(jié)果：
　　1.基因克隆和生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，牦牛腦AQP9CDS全長(zhǎng)氨基酸

3、序列與黃牛、藏羚羊、小鼠及人的同源性分別是89.49％、86.10%、74.92%及65.08%；其中除了與上述物種相比均缺失29個(gè)氨基酸的差異外，與同源性最高的黃牛相比僅有2個(gè)氨基酸的差異，即在牦牛的第9位為酸性氨基酸谷氨酸，而黃牛、藏羚羊及小鼠的均為堿性氨基酸賴氨酸；重要的是，牦牛的第273位與藏羚羊的相同均為高疏水性的亮氨酸，而低海拔物種黃牛、小鼠及人的均為低疏水性的脯氨酸；牦牛腦AQP9第191-220位缺失的29個(gè)氨基酸片段主

4、要集中在第五次跨膜與第三段胞外區(qū)域；且牦牛該蛋白具有較高折疊的二維結(jié)構(gòu)及差異化的三維構(gòu)象。
　　2.原位雜交定位分析結(jié)果表明，在牦牛大腦皮質(zhì)中，AQP9mRNA的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物在其分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層及多形層中均有分布，但分子層和顆粒層的著色最深，而多形層的著色最淺，該分布特征與黃牛的基本相似，但總體上牦牛的著色較黃牛的淺；在牦牛大腦海馬中，該陽(yáng)性產(chǎn)物在海馬皮質(zhì)和齒狀回顆粒層中均有分布，但齒狀回顆粒

5、細(xì)胞的著色最深，該分布特征與黃牛的也基本相似，同樣牦牛的著色也較黃牛的淺。Westernblotting結(jié)果表明，牦牛大腦皮質(zhì)和海馬AQP9蛋白的表達(dá)均低于黃牛的（P皮質(zhì)＜0.05；P海馬＞0.05）。
　　3.功能試驗(yàn)分析表明：（1）與轉(zhuǎn)染小鼠和人的相比，轉(zhuǎn)染牦牛PEGFP-AQP9質(zhì)粒的N2a細(xì)胞其綠色熒光的表達(dá)最低；（2）與轉(zhuǎn)染小鼠和人的相比，轉(zhuǎn)染牦牛PEGFP-AQP9質(zhì)粒的大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元的胞體較小、軸突與樹突的生長(zhǎng)明

6、顯被抑制，而大多數(shù)神經(jīng)元間未形成正常連接，且更明顯地促進(jìn)了大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡，尤其在低氧脅迫下；（3）在常氧狀態(tài)下，與轉(zhuǎn)染小鼠和人的相比，轉(zhuǎn)染牦牛的CAGTAG-AQP9質(zhì)粒較更能促進(jìn)N2a細(xì)胞的凋亡，然而，在低氧狀態(tài)下，轉(zhuǎn)染牦牛的CAGTAG-AQP9質(zhì)粒則較小鼠和人的更能抑制N2a細(xì)胞的凋亡；（4）在常氧狀態(tài)下，牦牛、小鼠及人AQP9的過表達(dá)下調(diào)Caspase-3，c-fos的蛋白表達(dá)，而上調(diào)Bax、Bcl-2和p53的蛋白表

7、達(dá)，然而，在低氧狀態(tài)下，牦牛、小鼠及人AQP9的過表達(dá)則上調(diào)Caspase-3、Bcl-2及c-fos的蛋白表達(dá)，而下調(diào)Bax和p53的蛋白表達(dá)，但不論在常氧還是低氧狀態(tài)下，牦牛的影響趨勢(shì)均最小。
　　結(jié)論：
　　1.在高原低氧適應(yīng)中，牦牛腦AQP9獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征如牦牛和藏羚羊AQP9第273位均為亮氨酸，而黃牛、人和小鼠的均為脯氨酸；牦牛該蛋白的第191-220位缺失29個(gè)氨基酸的片段；二級(jí)結(jié)構(gòu)較高的折疊及三維差異化的構(gòu)象

8、是該高原物種腦細(xì)胞對(duì)其低氧生境適應(yīng)的重要機(jī)制。
　　2.在高原低氧適應(yīng)中，牦牛腦AQP9的低表達(dá)特征（牦牛腦AQP9mRNA和蛋白的表達(dá)水平均低于低海拔物種黃牛的；且牦牛該蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的模式細(xì)胞系也具有其低表達(dá)特征）也是該高原物種腦細(xì)胞對(duì)其低氧生境適應(yīng)的重要機(jī)制之一。
　　3.在高原低氧適應(yīng)中，牦牛腦AQP9可能是通過自身的低表達(dá)直接或間接參與p53、Bcl-2/Bax值、c-fos及caspase-3等調(diào)控抵抗低氧