電針刺激聯(lián)合BMSCs移植治療對(duì)腦出血大鼠腦組織內(nèi) AQP-4、AQP-9及MMP-9蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、 目的：電針刺激聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)移植治療腦出血(Intracerebral Hemorrhage, ICH)大鼠,觀察出血灶周邊腦區(qū)腦水腫相關(guān)蛋白水通道蛋白4(aquaporins-4,AQP-4)、水通道蛋白 9 ( aquaporins -9 , AQP-9 )、基質(zhì)金屬蛋白酶 9 ( matrix metalloproteinase-9,M

2、MP-9)的表達(dá)變化,探討通過(guò)聯(lián)合治療能否促進(jìn)腦出血大鼠出血灶周邊腦區(qū)水轉(zhuǎn)運(yùn),減輕腦水腫,改善神經(jīng)缺失癥狀。方法：1.建立腦出血大鼠模型：利用腦立體定位儀向SD大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)注射肝素+Ⅰ型膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型,于術(shù)后2h、24h、48h進(jìn)行三次神經(jīng)損害程度評(píng)分(Neurological severity score,NSS 評(píng)分),任意一次評(píng)分大于 9分者入選實(shí)驗(yàn)組。2. 培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)：將冷凍保存并已作GFP標(biāo)記

3、的BMSCs進(jìn)行復(fù)蘇、傳代,當(dāng)生長(zhǎng)至細(xì)胞融合度為80%左右時(shí),換預(yù)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)24h,于移植前6h改用無(wú)血清誘導(dǎo)液誘導(dǎo),移植時(shí)收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×107個(gè)/ml用于移植。3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：生理鹽水組(Control組),造模后第3d沿相同手術(shù)入路向右側(cè)尾狀核區(qū)注入生理鹽水20μl；細(xì)胞移植組(BMSCs組),造模后第3d往出血灶內(nèi)移植BMSCs 20μl；電針治療組(electro-acupuncture therapy,Ea

4、組),造模后第3d開(kāi)始以連續(xù)波、頻率3Hz、強(qiáng)度1V的電針刺激大鼠百會(huì)穴和大椎穴,每天1次直至處死動(dòng)物；電針刺激聯(lián)合細(xì)胞移植組(electro-acupuncture combined with BMSCs transplantation,Ea-BMSCs 組),造模后第 3 天往出血灶移植BMSCs 20μl,細(xì)胞移植后2h開(kāi)始電針刺激,之后同電針治療組處理方法一致。4.按分組后喂養(yǎng)的時(shí)間不同將各組動(dòng)物再分為1d、3d、5d、7d及1

5、4d 5個(gè)亞組,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采血,收集血清,處死動(dòng)物取出腦組織。5.采用免疫組化 SABC 法觀察 AQP-4、AQP-9 及 MMP-9 在腦組織中的分布；Western-blotting檢測(cè)AQP-4在出血灶周邊腦區(qū)的表達(dá)變化；干濕法檢測(cè)出血灶周邊腦組織水含量；放射免疫法( RIA )測(cè)定血清中白細(xì)胞介素 2 (Interleukin-2,IL-2)的含量。結(jié)果：1.出血灶周邊腦組織水含量：①各組模型腦組織水含量在第3d開(kāi)始升高,第

6、5d達(dá)到峰值。②Ea組各時(shí)間點(diǎn)腦組織水含量均低于其余各組(p<0.05)。③Ea-BMSCs組只有5d、7d組腦組織水含量低于Control組(p<0.05)。④Ea-BMSCs組與BMSCs組之間比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)差異。2.出血灶周邊區(qū)腦組織AQP-4的表達(dá)變化：(1)免疫熒光雙標(biāo)顯示,AQP-4陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)于出血灶周邊腦區(qū)膠質(zhì)酸性纖維蛋白(GFAP)陽(yáng)性細(xì)胞上。(2)免疫組化檢測(cè)出血灶周邊腦區(qū) AQP-4 陽(yáng)性產(chǎn)物的OD值(平均光密度值)

7、：①Control組、BMSCs組和Ea BMSCs組AQP-4蛋白在第3d開(kāi)始升高,于第5d達(dá)到峰值,BMSCs組和Ea-BMSCs組在第 7d 后再度升高,而 Control 組和 Ea 組在達(dá)峰值后未見(jiàn)升高。②Ea-BMSCs組和BMSCs組在第1d、5d蛋白表達(dá)均低于Control組(p<0.05),在第14d表達(dá)卻高于Control組(p<0.05),且Ea-BMSCs組第 1d、5d的表達(dá)低于BMSCs組(p<0.05),而

8、第14d蛋白的表達(dá)與BMSCs組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)Western-blotting檢測(cè)出血灶周邊AQP-4陽(yáng)性物質(zhì)的灰度值：3.出血灶周邊區(qū)腦組織AQP-9的表達(dá)變化：免疫組化檢測(cè)出血灶周邊腦區(qū)AQP-9陽(yáng)性產(chǎn)物OD值顯示,①Control組、BMSCs組和Ea-BMSCs組AQP-9蛋白在第1d開(kāi)始升高,于第3d和7d第兩次達(dá)到峰值,而Ea組只于第7d達(dá)到峰值；②第3d,Ea-BMSCs組AQP-9表達(dá)高于Control組、BM

9、SCs組和Ea組(p<0.05),而B(niǎo)MSCs組與Control組和Ea組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；③第7d,Ea組、Ea-BMSCs組和BMSCs組AQP-9表達(dá)均高于Control組(p<0.05),Ea-BMSCs組AQP-9表達(dá)高于Ea組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),但Ea-BMSCs組與BMSCs組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4. 出血灶周邊區(qū)腦組織 MMP-9 的表達(dá)變化：(1)免疫熒光檢測(cè)可見(jiàn),MMP-9陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)于

10、出血灶及周邊腦區(qū),且隨著時(shí)間的推移,陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物逐漸減少。(2)免疫組化檢測(cè)出血灶周邊腦區(qū) MMP-9 陽(yáng)性產(chǎn)物OD值顯示,①Ea-BMSCs組和BMSCs組MMP-9表達(dá)于第1d開(kāi)始升高,第3d達(dá)到峰值,之后緩慢下降,Ea-BMSCs組于第7d開(kāi)始出現(xiàn)上升的趨勢(shì)。Control組和Ea組一直呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。②在第1d,Ea-BMSCs組和Ea組顯著低于BMSCs組和control組(p<0.05),但Ea-BMSCs組和Ea組之間

11、比較以及BMSCs組和control組之間比較,未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。③在第3d,Ea-BMSCs 組和 Ea組 MMP-9 表達(dá)低于 control組(p<0.05), Ea-BMSCs組高于Ea組(p<0.05)；BMSCs組高于control組(p<0.05)。④在第14d,Ea-BMSCs組和BMSCs組MMP-9表達(dá)均高于control組(p<0.05),Ea組低于control組(p<0.05),但Ea-BMSCs組、BMSCs組

12、組間比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.血清IL-2含量：①在第1d,各組之間含量無(wú)差異；②從第 3d 開(kāi)始,BMSCs 組顯著高于其余各組(P<0.05),而后迅速降低,于第5d與control組相近,隨后開(kāi)始升高。③從第5d開(kāi)始,Ea-BMSCs組 IL-2 表達(dá)才顯著高于 control 組和 BMSCs 組(P<0.05),且該組 IL-2的含量一直在較高水平上緩慢下降；④Ea 組在第 3d 與其余各組比較出現(xiàn)顯著降低(P<0.05),但從

13、第5d開(kāi)始高于移植組和control組(P<0.05),于第14d顯著增高,與其余各組相比,P<0.05。結(jié)論：1.電針聯(lián)合BMSCs移植可在腦出血急性期抑制AQP-4的表達(dá),減輕局部腦水腫,急性期后可促進(jìn) AQP-4 表達(dá)上調(diào),加快水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)水腫消散。2.電針聯(lián)合BMSCs 移植可在腦出血后期上調(diào) AQP-9 的表達(dá),加快腦水腫的消散和促進(jìn)腦能量代謝的恢復(fù)。3.BMSCs移植治療早期可促進(jìn) MMP-9 的表達(dá),加重腦水腫,BM