MMP-2、MMP-9對腦出血損傷大鼠實驗研究.pdf

1、目的：腦出血(intracerebralhemorrhage，ICH)后繼發(fā)損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，至今未闡明，近幾年來研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)是導(dǎo)致ICH后繼發(fā)損傷重要因素，能促進炎癥反應(yīng)發(fā)生，加重腦水腫，使神經(jīng)功能缺失加重。本實驗通過觀察大鼠ICH后基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmeta

2、lloproteinase，MMP-9)蛋白動態(tài)表達及其與血腫周圍腦組織含水量的關(guān)系，和觀察七葉皂苷鈉對MMP-2、MMP-9表達的影響，探討MMP-2、MMP-9在ICH的損傷機制，進一步了解ICH后繼發(fā)損傷的病理生理過程，為治療ICH提供理論依據(jù)。 方法：將雌雄各半Wistar大鼠250只隨機分為4組：正常對照組、假手術(shù)組、ICH組和七葉皂苷鈉治療組。每組均觀察手術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、120h、7d、15

3、d八個時間點各觀察指標的改變，每個時間點10只大鼠。治療組模型：按照50mg/kg.d七葉皂苷鈉在各時間點向大鼠ICH腹腔注射。ICH組模型：采用立體定向儀把自體血注入大鼠右側(cè)尾狀核制作大鼠ICH動物模型。假手術(shù)組模型：手術(shù)操作程序與ICH組相同，但尾狀核不注入自體血，針留置約10分鐘。正常對照組模型：大鼠不進行手術(shù)。在術(shù)后2h進行模型成功評價，分別于術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、120h、7d、15d進行神經(jīng)功能障礙評分。

4、在術(shù)后各相應(yīng)時間點取5只大鼠灌注固定后取材作腦片，進行免疫組織化學染色和HE染色，觀察MMP-2、MMP-9蛋白動態(tài)表達。根據(jù)顯色的強弱，將免疫組織化學的結(jié)果分為4級：(一)為陰性，(+)為弱陽性，(++)為中等陽性，(+++)為強陽性。取連續(xù)組織切片在同一強度及放大倍數(shù)觀察，采用陽性細胞計數(shù)法。每只大鼠每個指標選一張腦切片，在400倍光鏡下隨機選測血腫周圍的4個互不重疊的視野，每個時點共計20個視野，計數(shù)每個視野的該指標陽性細胞數(shù)，取

5、均數(shù)為各時點該指標陽性細胞數(shù)。另取5只大鼠在術(shù)后各相應(yīng)時間點斷頭取腦組織，用干濕重法測定血腫周邊腦組織含水量。 結(jié)果：在實驗過程中36只大鼠死亡，ICH組和治療組有15只大鼠手術(shù)后模型評價為0級，手術(shù)成功率84.75％。ICH組在6h～120h的神經(jīng)功能評分與正常對照組、假手術(shù)組、治療組比較，神經(jīng)功能評分下降，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。在ICH組，24h～48h神經(jīng)功能評分顯著降低，在48

6、h神經(jīng)功能評分與24h相比，差異無顯著性(P=0.51)，與其它各時點相比，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000)；ICH組在6h～72h腦組織含水量與正常對照組、假手術(shù)組、治療組比較，血腫周圍腦組織含水量升高，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000,P=0.000)；在ICH組，24h～48h血腫周圍腦組織含水量達高峰，在48h血腫周圍腦組織含水量與24

7、h相比，差異無顯著性(P=0.16)，與其它各時點相比，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000)；ICH組各時間點MMP-2蛋白表達與正常對照組、假手術(shù)組、治療組比較，MMP-2蛋白表達升高，差異具有顯著性(P=0.000,P=0.000，P=0.000)；在ICH組，MMP-2蛋白表達在6h達到高峰，與其它各時間點相比較，差異具有顯著性(P=0.000;P=0.0

8、00，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000)；ICH組各時間點MMP-9蛋白表達與正常對照組、假手術(shù)組、治療組比較，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000)；在ICH組，MMP-9蛋白表達在24h～48h達高峰，在24hMMP-9蛋白表達與48h相比，差異無顯著性(P=0.119)，與其它各時間點比較，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0

9、.000，P=0.000，P=0.000)；在假手術(shù)組，MMP-2蛋白表達與血腫周圍腦組織含水量無相關(guān)性(r=0.135，P=0.751)，MMP-9蛋白表達與血腫周圍腦組織含水量無相關(guān)性(r=-0.433，P=0.284)，MMP-2蛋白表達與MMP-9蛋白表達無相關(guān)性(r=-0.505，P=0.202)。在ICH組，MMP-2蛋白表達與血腫周圍腦組織含水量無相關(guān)性(r=-0.009，P=0.983)，MMP-9蛋白表達與血腫周圍腦組

10、織含水量有相關(guān)性(r=0.949，P=0.000)，MMP-2蛋白表達與MMP-9蛋白表達無相關(guān)性(r=0.038，P=0.928)。在治療組，MMP-2蛋白表達與血腫周圍腦組織含水量無相關(guān)性(r=-0.434，P=0.284)，MMP-9蛋白表達與血腫周圍腦組織含水量有相關(guān)性(r=0.907,P=0.002)，MMP-2蛋白表達與MMP-9蛋白表達無相關(guān)性(r=-0.076，P=0.858)。HE染色：正常對照組、假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)

11、構(gòu)完整，各層細胞排列整齊，無腫脹。ICH組大鼠腦組織在注血后6h可見血腫周圍散在中性粒細胞等炎細胞浸潤；24h可見神經(jīng)細胞數(shù)目減少，排列紊亂，神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞輕度腫脹，大量中性粒細胞浸潤；48h血腫周圍細胞腫脹明顯，神經(jīng)細胞變性、壞死，出現(xiàn)大量泡沫細胞，組織疏松明顯，表現(xiàn)重度水腫；120h軟化區(qū)組織疏松減輕，小膠質(zhì)細胞增生，可見少許新生毛細血管。七葉皂苷鈉治療后與上述病理改變有不同程度的改善。 結(jié)論：自體血制作大鼠ICH動物模

12、型，制作方法簡單，易于操作，與人腦出血病理生理變化基本一致，可作廣泛使用ICH動物模型。ICH后大鼠腦組織內(nèi)MMP-2、MMP-9的蛋白表達增加及腦組織含水量增多，說明MMP-2、MMP-9參與了BBB的損傷，加重腦水腫。MMP-2的蛋白表達在6h達高峰，以后逐漸下降，說明MMP-2主要在早期參與BBB的損害，促進腦水腫的形成；MMP-9蛋白表達開始在6h上升，24h～48h達高峰，以后逐漸下降，說明MMP-9主要在中、晚期參與BBB的