胰島素及PI3K-AKT信號(hào)通路抑制劑對(duì)人正常肝細(xì)胞AQP9表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討胰島素對(duì)人正常肝細(xì)胞膜上水通道蛋白AQP9表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及P13K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路在胰島素調(diào)控AQP9表達(dá)的作用及意義。
　　 方法：正常成人L-02肝細(xì)胞株,用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察正常肝細(xì)胞株L-02中AQP9的表達(dá)部位。建立胰島素濃度梯度肝細(xì)胞株模型:分別予以100nM/L、250nM/L、500 nM/L胰島素濃度作用于呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的正常肝細(xì)胞株L-02孵育24小

2、時(shí)后收獲細(xì)胞；建立時(shí)間梯度模型:加入胰島素刺激后分別于3h、6h、12h、及24h收獲細(xì)胞。建立藥物刺激模型:于正常培養(yǎng)L-02肝細(xì)胞株中分別予以PI3K抑制劑LY294002、AKT抑制劑A-443654、MAPK抑制劑SB2030580刺激后再予以最佳濃度(500 nM/L)胰島素刺激24h后收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞均通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組肝細(xì)胞內(nèi)AQP9mRNA變化、Western Blot檢測(cè)各組肝細(xì)胞內(nèi)AQP9蛋白表達(dá)變化。

3、>　　 結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示AQP9的陽(yáng)性產(chǎn)物在正常肝細(xì)胞株L-02中表達(dá)豐富,主要位于肝細(xì)胞膜上,而細(xì)胞漿和細(xì)胞核中無(wú)表達(dá)。成功建立了胰島素濃度及時(shí)間梯度模型,AQP9表達(dá)從胰島素濃度100nM/L開(kāi)始表達(dá)降低,500nM/L時(shí)降低最明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；而在胰島素以500nM/L作用細(xì)胞后,AQP9表達(dá)從3h開(kāi)始轉(zhuǎn)錄逐漸降低,6 h與3 h無(wú)明顯差異,而12 h時(shí)抑制作用最明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.0

4、5)；PI3K抑制劑LY294002、AKT抑制劑A-443654處理細(xì)胞后再次予以胰島素刺激AQP9蛋白表達(dá)較只有胰島素作用細(xì)胞時(shí)表達(dá)增加,而MAPK抑制劑處理后則沒(méi)有明顯變化,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　 結(jié)論：人正常肝細(xì)胞膜上AQP9的表達(dá)受胰島素呈濃度及時(shí)間依賴調(diào)控,及胰島素濃度越大及作用時(shí)間越長(zhǎng),AQP9的表達(dá)抑制越明顯。應(yīng)用PI3K及AKT特異性抑制劑后,胰島素對(duì)AQP9表達(dá)的抑制作用減弱,而阻斷MARA