胰島素對高糖環(huán)境下人牙周膜細(xì)胞促炎因子和OPG-RANKL表達(dá)的影響及PI3K-Akt通路作用的研究.pdf

1、研究背景
　　牙周炎(Periodontitis)已被公認(rèn)為是糖尿病(Diabetesmellitum，DM)的第六并發(fā)癥。它們之間存在共同危險因素且互為高危因素。近年來，糖尿病也被認(rèn)為是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，炎癥成為糖尿病和牙周炎的共同基礎(chǔ)。炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子參與了糖尿病的全過程，并與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　糖尿病引起的骨代謝異?？赡苁茄啦酃俏罩卵例X缺失的重要因素之一。大量的研究表明糖尿病可以增加牙周炎的患病風(fēng)

2、險并且加重牙周炎的嚴(yán)重程度。臨床試驗表明糖尿病患者伴發(fā)牙周炎的風(fēng)險是非糖尿病患者的3～4倍。糖尿病患者牙周附著喪失及牙槽骨吸收的程度都比非糖尿病患者高。糖尿病與其并發(fā)癥之間的關(guān)系主要在于血糖的控制，而胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，近年來還發(fā)現(xiàn)其具有抗炎作用。經(jīng)胰島素治療的糖尿病患者伴發(fā)牙周炎的風(fēng)險降低并且病情較輕。但是糖尿病代謝水平的控制和牙周炎之間的確切機(jī)制至今尚不清楚，胰島素在其中又是有著怎樣的調(diào)控作用呢？
　　牙周炎是慢

3、性感染性疾病，主要表現(xiàn)為牙周組織破壞、牙周袋形成、牙槽骨吸收。牙周膜（periodontalligament,PDL）位于牙槽骨與牙骨質(zhì)之間，其可影響牙槽骨形成－骨吸收之間平衡，在維持牙周組織代謝平衡中具有重要作用。牙周膜成纖維細(xì)胞不僅在牙周膜的形成和維持中起重要作用，也在相鄰組織牙槽骨和牙骨質(zhì)的修復(fù)、重建和再生中起重要作用。牙周炎癥時可以誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞分泌促炎因子特別是IL-1、IL-6、TNF-α參與病變過程。這些促炎因子可以通過破

4、骨細(xì)胞形成相關(guān)因子OPG/RANKL比例的改變來影響骨改建。
　　胰島素是細(xì)胞代謝的重要調(diào)節(jié)激素，同時也能促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化，尤其是對骨代謝相關(guān)細(xì)胞的作用引起人們的普遍關(guān)注。有研究表明，胰島素可以促進(jìn)骨合成代謝，通過直接或間接作用影響骨形成，預(yù)防骨流失，從而提高骨密度和骨強(qiáng)度。牙周膜細(xì)胞(Periodontalligamentcell,PDLc)是牙周組織再生的主要細(xì)胞群，既有成纖維細(xì)胞的表現(xiàn)型又有成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的表現(xiàn)型

5、。胰島素與牙周炎的關(guān)系在以往的研究主要集中在胰島素治療前后糖尿病患者牙周炎程度或糖尿病動物牙周組織變化的臨床或動物實驗上，而關(guān)于胰島素對牙周骨吸收的影響及細(xì)胞分子作用機(jī)制的研究很少。
　　磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositide-3kinase,PI3K）-蛋白激酶B（Akt/PKB）途徑，是細(xì)胞內(nèi)一條主要信號通路，可以調(diào)節(jié)葡萄糖攝取、細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。在內(nèi)毒素、TNF-α刺激單核/巨噬細(xì)胞時

6、，PI3K-AKT通路的激活可以降低單核/巨噬細(xì)胞的進(jìn)一步活化，以減少炎性細(xì)胞因子的分泌。PI3K-Akt通路在骨細(xì)胞的增殖，分化中也起重要作用。
　　研究目的
　　①人牙周膜細(xì)胞體外培養(yǎng)與鑒定；
　　②葡萄糖、胰島素對人牙周膜細(xì)胞增殖活性的影響；
　?、燮咸烟?、胰島素對人牙周膜細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響；
　?、芷咸烟?、胰島素對人牙周膜細(xì)胞OPG/RANKL表達(dá)的影響；

7、　?、軵I3K-Akt信號途徑否參與葡萄糖、胰島素對人牙周膜細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6及OPG/RANKL表達(dá)的調(diào)控。
　　研究方法
　　①采用酶消+組織塊法體外原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，波形絲蛋白、角蛋白用免疫熒光染色法進(jìn)行細(xì)胞鑒定；
　?、趯⒓?xì)胞在不同葡萄糖濃度(5.5、25、45mM)的礦化培養(yǎng)液中誘導(dǎo)21d，鈣結(jié)節(jié)染色探討葡萄糖對人牙周膜細(xì)胞成骨特性的影響；
　?、蹖⒓?xì)胞在不同葡萄糖濃度(5

8、.5、25、45mM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入不同濃度I-8、I-7、I-6（10－8，10－7或10-6mM胰島素）培養(yǎng)1、3、5、7d，MTT法檢測細(xì)胞增殖；
　?、軐⒓?xì)胞在不同葡萄糖濃度(5.5、25、45mM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以5.5mM葡萄糖濃度培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞為空白對照，45mM葡萄糖濃度培養(yǎng)液中再加入不同濃度（10－8，10－7或10-6mM）的胰島素，培養(yǎng)6、12、24、48h，收集培養(yǎng)上清液，ELISA檢測人牙周膜

9、細(xì)胞促炎因子的蛋白表達(dá)。0.2％TxitonX-100裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，ELISA檢測人牙周膜細(xì)胞OPG、RANKL的蛋白表達(dá)。采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，Q-PCR檢測人牙周膜細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6及OPG/RANKLmRNA的表達(dá)；
　　⑤為了解PI3K-Akt信號途徑在高糖誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞生成細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控中的作用，加入PI3K-Akt通路特異性抑制劑10μMLY294002進(jìn)行干

10、預(yù)，Q-PCR檢測6h時人牙周膜細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)及12h時OPG、RANKLmRNA的表達(dá)。Westernblot檢測6h的Akt/P-Akt蛋白水平的變化。
　　實驗結(jié)果
　?、袤w外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞波形絲蛋白染色呈陽性，角蛋白染色陰性；
　?、谂c對照組(5.5mM葡萄糖礦化誘導(dǎo)液)相比，25mM組可見少量散在的礦化基質(zhì)，但45mM組未見明顯的礦化結(jié)節(jié)；
　　③與對照組

11、相比，25mM組提高了細(xì)胞的增殖活性，差異具有顯著性。而45mM組明顯降低了細(xì)胞的增殖活性，但胰島素可以逆轉(zhuǎn)這種趨勢增加細(xì)胞增殖活性；
　?、芘c對照組相比，隨糖濃度越高，促炎因子表達(dá)呈增多趨勢；45mM組人牙周膜細(xì)胞促炎因子蛋白及mRNA表達(dá)顯著增高，而胰島素可以抑制高糖誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的分泌及mRNA的表達(dá)；
　　⑤與對照組相比，高糖環(huán)境對OPG表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，同時可顯著促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞RA

12、NKLmRNA表達(dá)、蛋白的分泌；胰島素可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的RANKL表達(dá)，且可促進(jìn)OPG的表達(dá)；
　　⑥PI3K-AKT通路特異性抑制劑LY294002在6h時顯著下調(diào)了胰島素對高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)的抑制作用，但是對IL-6的影響并不顯著。LY294002對12hOPG/RANKL的影響并不顯著；
　?、吒咛且种屏?h時Akt的磷酸化，胰島素可以增強(qiáng)高糖下p-Akt的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：

13、
　?、倜赶?組織塊培養(yǎng)法可以獲得大量高純度的人牙周膜細(xì)胞，細(xì)胞活性好，增殖能力強(qiáng)；
　?、诟咛黔h(huán)境對人牙周膜細(xì)胞的成骨分化有一定的抑制作用，抑制其體外誘導(dǎo)的礦化結(jié)節(jié)形成；
　　③隨葡萄糖濃度增高，人牙周膜細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)繼而轉(zhuǎn)入降低，表現(xiàn)出一定的糖耐受效應(yīng)。高濃度的葡萄糖（45mM）降低了人牙周膜細(xì)胞的增殖活性，但胰島素可以逆轉(zhuǎn)這種趨勢，顯著增加細(xì)胞增殖活性；
　　④高糖環(huán)境可以促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞促炎因子IL-