Delftia tsuruhatensis AD9苯胺降解關(guān)鍵酶基因的功能鑒定和表達(dá)調(diào)節(jié)研究.pdf

1、苯胺是一種難降解、毒性大、可對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重危害的典型有機(jī)污染物。苯胺降解菌株DelftiatsuruhatensisAD9分離自印染廠活性污泥，其最高耐受苯胺濃度為4500mg/l。以起始濃度1500mg/l苯胺為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)，30小時(shí)達(dá)到最大生長(zhǎng)量(OD600=1.193;在以300mg/l鄰苯二酚為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)29小時(shí)達(dá)到最大生長(zhǎng)量(OD600=0.88)。 采用氧化電極測(cè)定分子氧吸收率的方法，測(cè)定AD9的

2、苯胺雙加氧酶活性為82±6mgO2g-dry-wt-1h-1，而內(nèi)源呼吸僅為30±6mgO2g-dry-wt-1h-1，表明AD9具有非常明顯的苯胺雙加氧酶活性。利用測(cè)定積累產(chǎn)物吸光值的方法，測(cè)定AD9的鄰苯二酚2,3雙加氧酶酶活為5.8u(mgcrudeprotein)-1，而鄰苯二酚1，2雙加氧酶的活性僅為0.5u(mgcrudeprotein)-1，表明AD9的苯胺代謝方式為間位裂解途徑。 在克隆AD9完整的苯胺降解基因簇

3、并完成核甘酸全序列測(cè)定(GENBANK登陸號(hào)AY940090)的基礎(chǔ)上，本論文利用Fruitfly計(jì)算機(jī)軟件分析和Blast序列比對(duì)，推測(cè)在AD9苯胺基因簇中可能存在著兩個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和兩個(gè)LysR型調(diào)控蛋白。第一個(gè)啟動(dòng)子位于苯胺降解基因簇前端，受LysR型調(diào)控蛋白TadR的調(diào)控，控制苯胺雙加氧酶基因tadQTA1A2B和鄰苯二酚雙加氧酶基因tadC1的表達(dá)；第二個(gè)啟動(dòng)子位于基因orfS與tadD2之間，可能受OrfS的調(diào)控，控制基因簇

4、中第二組鄰苯二酚雙加氧酶基因tadC2的表達(dá)。分析了兩個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、-10區(qū)和-35區(qū)序列以及調(diào)控蛋白在啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)序列，預(yù)測(cè)其表達(dá)均為σ70因子依賴型。預(yù)測(cè)了OrfS的三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。 為驗(yàn)證兩個(gè)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的表達(dá)功能，采用載體pGD926和pPR9TT分別構(gòu)建了兩個(gè)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的lacZ融合性廣宿主表達(dá)載體，分別命名為pGDP和pSDP。通過三親接合方法將pGDP和pSDP導(dǎo)入AD9

5、中，在不同底物誘導(dǎo)下測(cè)定了結(jié)合子的β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果表明：AD9苯胺降解基因簇中第一個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)受到苯胺和對(duì)甲苯胺的誘導(dǎo)，第二個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)受到苯胺的降解中間產(chǎn)物—鄰苯二酚的誘導(dǎo)和對(duì)甲苯胺的降解中間產(chǎn)物—4-甲基鄰苯二酚的誘導(dǎo)。通過RT-PCR的方法驗(yàn)證了第一個(gè)操縱子和基因orfS的表達(dá)受到苯胺的誘導(dǎo)，第二個(gè)操縱子的表達(dá)受到苯胺和鄰苯二酚的表達(dá)，并且鄰苯二酚的誘導(dǎo)作用要高于苯胺的誘導(dǎo)作用?；谝陨瞎ぷ骱拖嚓P(guān)文獻(xiàn)推測(cè)了AD9降解基