乙酰肝素酶調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞功能及其基因表達(dá)譜變化研究.pdf

1、目的：
　　 探討乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響；闡明HPSE基因在胃癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育、炎癥反應(yīng)及腫瘤轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)生物過程中的可能分子機(jī)制
　　 方法
　　 1、siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞乙酰肝素酶基因表達(dá)及其生物學(xué)行為的影響
　　 ①應(yīng)用RT-PCR技術(shù)篩選HPSE基因高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株。②設(shè)計(jì)、合成反義寡脫氧核苷酸（AS-ODN）及對(duì)照寡脫氧核苷酸（NS-O

2、DN），轉(zhuǎn)染高表達(dá)HPSE基因的胃癌細(xì)胞株，利用Real-Time PCR技術(shù)確定沉默效果最佳的siRNA濃度，并運(yùn)用Real-Time PCR和Western Blot技術(shù)分別在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證對(duì)HPSE基因表達(dá)的沉默效果。③應(yīng)用透射電鏡觀察HPSE siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901形態(tài)學(xué)的影響；采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測HPSE siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響。④應(yīng)用Matri

3、gel侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究HPSE siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲力和遷移能力的影響。
　　 2、乙酰肝素酶反義寡核苷酸對(duì)胃癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響
　　 應(yīng)用Affymetrix Human U133 Plus2基因芯片技術(shù)，分別提取siRNA抑制HPSE基因表達(dá)前后胃癌細(xì)胞SGC-7901的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)一步熒光標(biāo)記后進(jìn)行芯片雜交，雜交結(jié)果經(jīng)掃描及軟件分析，最后Ratio值為Cy3/Cy

4、5（即實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組）。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為正標(biāo)Rmio（Cy3/Cy5）≥2，同時(shí)反標(biāo)Ratio（Cy3/Cy5）≤0.5。分析siRNA抑制HPSE基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中受HPSE調(diào)控的下游基因表達(dá)譜的變化，并且部分上調(diào)及下調(diào)基因的表達(dá)水平用Real-Time PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)于差異表達(dá)在2倍以上的基因，我們利用博奧公司的MAS3.0分析軟件進(jìn)行了GO分析，并對(duì)差異表達(dá)在1.5倍以上的基因進(jìn)行了Pathway分析。
　　

5、結(jié)果
　　 1、siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞乙酰肝素酶基因表達(dá)及其生物學(xué)行為的影響
　　 ①RT-PCR技術(shù)檢測胃癌細(xì)胞株中HPSE基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示SGC-7901細(xì)胞表達(dá)HPSE最高，故選用SGC-7901細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。②RT-PCR技術(shù)及Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默效果最好的siRNA濃度為10 nM。⑦Real-Time PCR及Western Blot檢測：相對(duì)于陰性對(duì)照NC組（無義siRNA對(duì)照組

6、），siRNA沉默組的HPSE基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)量顯著降低。④siRNA沉默HPSE基因后，透射電鏡結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞SGC-7901形態(tài)學(xué)發(fā)生典型的凋亡現(xiàn)象；Annexin V-FITC/PI雙柒流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多，由正常細(xì)胞的1.58％升高為8.45％。⑤Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA沉默HPSE基因后的胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲到Transwell膜后面的細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組顯著減少（P

7、<0.01），表明HPSE基因沉默明顯降低胃癌細(xì)胞的侵襲能力。利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示，HPSE基因沉默的胃癌細(xì)胞在劃痕后24h、36h的寬度明顯大于對(duì)照組（P<0.05），表明抑制HPSE基因可明顯降低胃癌細(xì)胞的遷移能力。
　　 2、乙酰肝素酶反義寡核苷酸對(duì)胃癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響
　　 Affymetrix芯片結(jié)果表明，siRNA沉默HPSE基因后，胃癌細(xì)胞SGC7901中VEGF信號(hào)通路的中心介

8、導(dǎo)分子PRKCA和PRKCB的表達(dá)明顯下降；介導(dǎo)VEGFR-2通路的錨定蛋白SHB、VEGFR-2的相互作用蛋白VE-cadherin、炎癥因子IL-1a/IL-1b表達(dá)下降，介導(dǎo)天然免疫的分子DEFB1、黏附分子CD44表達(dá)升高。
　　 結(jié)論
　　 1、siRNA沉默HPSE基因后，降低胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲和遷移能力；
　　 2、siRNA沉默HPSE基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901中VEGF信號(hào)

9、通路的中心介導(dǎo)分子PRKCA和PRKCB的及傳遞該通路信號(hào)的重要分子SHB和VE-cadherin表達(dá)均下降，但跨膜糖蛋白CD44表達(dá)升高，這些分子改變可能共同參與了HPSE干涉后的血管生成抑制過程。
　　 3、siRNA沉默HPSE基因后，SHB、VE-cadherin表達(dá)下降，CD44表達(dá)升高，F(xiàn)AK通路受到抑制，這些因素可能共同作用導(dǎo)致胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡增加。
　　 4、siRNA沉默HPSE基因后，炎