Delftia tsuruhatensis AD9苯胺降解基因表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、DelftiatsuruhatensisAD9能以苯胺或鄰苯二酚為唯一碳源和氮源進(jìn)行生長。與目前已報道的其它苯胺降解菌比較，該菌表現(xiàn)出較高的苯胺降解速率和較強(qiáng)的苯胺耐受能力。本研究采用基因敲除、lacZ融合表達(dá)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)以及熒光定量PCR等方法，開展了D.tsuruhatensisAD9苯胺降解調(diào)控蛋白TadR的功能鑒定和tad基因簇表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究。 D.tsuruhatensisAD9苯胺降解基因簇組成結(jié)構(gòu)分析表明，苯

2、胺降解基因分布在三個操縱子。氨基酸序列分析表明，D.tsuruhatensisAD9的TadR屬于LysR-type家族的調(diào)控蛋白，與苯胺降解菌PseudomonasputidaUCC22的TdnR有97.6％的同源性；OrfS同樣屬于LysR-type家族調(diào)控蛋白，與苯酚降解菌ComamonastestosteroniTA441的AphT氨基酸序列有69％的同源性。苯胺降解基因簇結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可能受到這兩個LysR-type蛋白的調(diào)控

3、。 為了驗(yàn)證苯胺降解基因簇的表達(dá)調(diào)控，本工作構(gòu)建了tadR的缺失插入突變株。tadR突變株不能以苯胺為唯一碳源生長，但可以利用鄰苯二酚作為唯一碳源進(jìn)行生長，互補(bǔ)菌株能以苯胺為唯一碳源生長，說明tadR是苯胺降解基因簇中一個重要的基因。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)初步證明TadR蛋白在體外能和苯胺降解基因簇的tadQ啟動子結(jié)合。利用RT-PCR和實(shí)時熒光定量PCR對比分析野生型AD9和突變株AD91苯胺降解基因表達(dá)情況的差異，結(jié)果表明在苯胺存在

4、情況下，tadR基因正調(diào)控第一個操縱子的表達(dá)，同時也調(diào)控orfS基因的表達(dá)。 為研究基因的表達(dá)情況，構(gòu)建了tadQ::lacZ和tadD2::lacZ的融合表達(dá)載體，并分別導(dǎo)入到野生型AD9和突變株AD91中。β-半乳糖苷酶分析表明，苯胺降解基因組成兩個操縱子：tadQTA1A2BRD1C1操縱子編碼苯胺雙加氧酶和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶，tadD2C2EFGIJKL操縱子編碼鄰苯二酚間位降解酶系。tadQ啟動子的表達(dá)在Tad

5、R蛋白存在情況下受苯胺誘導(dǎo)。tadD2啟動子受到鄰苯二酚，粘糠酸和2-羥基苯胺的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)譜結(jié)果顯示，氯代苯胺對該tadQ啟動子也有誘導(dǎo)作用，特別是4-氯苯胺的誘導(dǎo)作用比苯胺更為明顯。HPLC分析表明，AD9不能降解2-氯苯胺和3-氯苯胺，在生長的后期可以降解微量的4-氯苯胺。鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活分析表明，TadC1在苯胺降解基因簇中起主要作用，TadC2對鄰苯二酚的降解可能起補(bǔ)償作用。 PtadQ砌口啟動子5’端缺失