綠盲蝽氣味降解酶相關(guān)基因的鑒定及功能初步研究.pdf

1、盲蝽蟓屬于半翅目盲蝽科，是我國棉花生產(chǎn)上一類重要害蟲，每年在全世界都對棉花產(chǎn)量造成巨大的損失。目前在我國各棉區(qū)已發(fā)現(xiàn)的棉盲蝽有20余種，其中危害比較嚴重的種類，有綠盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三點盲蝽和牧草盲蝽。自1997年起，隨著Bt棉花的廣泛種植，有效地控制了以棉鈴蟲為主的鱗翅目害蟲的危害，棉盲蝽種群發(fā)生數(shù)量劇增，由棉花的次要害蟲上升為主要害蟲之一。綠盲蝽已成為我國黃河流域、長江流域棉區(qū)危害最嚴重的優(yōu)勢種群。目前防治盲蝽主要靠化學(xué)農(nóng)藥

2、，這不僅容易導(dǎo)致盲蝽抗藥性的產(chǎn)生，而且對環(huán)境造成了巨大的污染和破壞，這就使得開發(fā)綠色環(huán)境友好型防治綠盲蝽的新方法和新技術(shù)顯得尤為重要。目前，通過干擾靶標昆蟲的嗅覺過程來對其進行有效控制是昆蟲行為調(diào)控的研究熱點。
　　 昆蟲識別配偶釋放的性信息素或植物的揮發(fā)性氣味是通過位于昆蟲嗅覺感器中的相關(guān)蛋白來實現(xiàn)的，包括氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory pro

3、teins，CSPs)、嗅覺受體(olfactory receptors，Ors)、氣味降解酶(odorant degrading enzymes，ODEs)和嗅覺神經(jīng)元膜蛋白(sensoryneuron membrane proteins，SNMPs)。昆蟲的嗅覺反應(yīng)包括一系列連續(xù)的反應(yīng)：包括氣味分子的結(jié)合，氣味分子在感器淋巴液內(nèi)的運輸，氣味分子與受體的結(jié)合，信號的轉(zhuǎn)化，傳導(dǎo)與終止。其中，信號的終止在嗅覺反應(yīng)中起著非常重要的作用，不僅

4、避免了嗅覺器官受到連續(xù)的化學(xué)刺激同時還減小了信號飽和性的干擾。
　　 本研究以綠盲蝽為研究對象，通過SMART技術(shù)成功構(gòu)建綠盲蝽觸角的cDNA文庫并進行詳細的生物信息學(xué)分析，鑒定大量嗅覺相關(guān)基因，篩選出氣味降解相關(guān)基因，結(jié)果獲得谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因序列共27條，酯酶(EST)基因序列共12條，細胞色素P450氧化還原酶基因序列共31條。同時結(jié)合SMARTerTMRACE技術(shù)克隆有關(guān)的氣味降解酶(ODEs)基因，成功

5、克隆出一個新的綠盲蝽酯酶基因的全長序列，全長1810bp，開放閱讀框為1713bp，編碼571個氨基酸。對這條序列命名為Aluc EST1，Gene bank登陸號為JQ715614。預(yù)測蛋白分子量為分子量63.44Kd，等電點(PI)為5.99。為研究綠盲蝽氣味降解酶生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。隨后克隆了兩個綠盲蝽內(nèi)參基因，并采用RT-PCR半定量和Real-time QPCR技術(shù)解析Aluc EST1在不同組織的表達圖譜。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該

6、酯酶基因在綠盲蝽的觸角、頭、胸、腹、足、翅各部位都有表達。其中在胸腹部的表達量最高，該基因在觸角中也有大量表達。同時利用酶與底物的相互作用關(guān)系進行酶活力的測定，本研究以α-醋酸萘酯為底物，固藍RR鹽為顯色劑反應(yīng)，測定了Aluc EST1的酶活力為1.224868(m OD·min-1·mg-1)。通過以α-/β-乙酸萘酯為底物，對綠盲蝽酯酶圖譜進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在綠盲蝽的成蟲中，能看到兩條清晰的條帶，并且相同的條帶在綠盲蝽的若蟲中也可以