綠盲蝽對毒死蜱的抗性機理研究.pdf

1、自1997年以來，隨著轉(zhuǎn)Bt基因棉花的大面積推廣種植，我國棉田害蟲的治理方式發(fā)生了一系列變化，棉田害蟲種群也隨之發(fā)生演替。盲蝽逐漸從棉田次要害蟲上升成為主要害蟲并波及到多種重要作物、蔬菜及果樹，其中綠盲蝽為盲蝽種群的優(yōu)勢種之一，在我國分布最廣、為害最重。近年來，在我國各地隨著盲蝽為害程度的不斷加重，防治盲蝽的力度也持續(xù)加強，而化學(xué)防治的速效高效性使之成為盲蝽綜合防治體系中過度依賴的植保技術(shù)，毒死蜱等有機磷殺蟲劑成為棉田盲蝽化學(xué)防治的常規(guī)

2、藥劑。殺蟲劑的過度及不合理使用將導(dǎo)致盲蝽對其敏感性降低，抗藥性問題不可避免。
　　我國對于盲蝽的抗性監(jiān)測及抗性機制研究尚處于起步階段，報道較少且缺乏系統(tǒng)性的研究。本文在室內(nèi)篩選并獲得抗性品系的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究了綠盲蝽對毒死蜱的抗性機制。通過代謝酶活性測定、活體增效試驗排除了酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、多功能氧化酶與綠盲蝽毒死蜱抗性的關(guān)系;通過AChE動力學(xué)參數(shù)測定、ace1基因克隆、基因表達水平定量和基因突變頻率檢測明確了靶標AC

3、hE敏感性下降與綠盲蝽毒死蜱抗性密切相關(guān)，并首次發(fā)現(xiàn)綠盲蝽ace1基因A216S突變是BZ-R品系對毒死蜱產(chǎn)生高水平抗性的主要機理。本文的研究結(jié)果闡明了綠盲蝽對毒死蜱的抗性機制，為建立綠盲蝽對毒死蜱抗性的分子檢測技術(shù)及制定相應(yīng)的抗性治理對策提供了重要理論依據(jù)。
　　1.綠盲蝽毒死蜱抗性品系的篩選
　　采用浸液法對2009年7月采自山東省濱州市無棣縣的綠盲蝽種群(BZ)進行了23代的室內(nèi)篩選，并最終獲得綠盲蝽毒死蜱抗性品系(B

4、Z-R)，毒死蜱對其致死中濃度為75.35 mg·L-1。BZ-R品系對毒死蜱的抗性是BZ品系的10倍，是敏感品系(SLF)的59.8倍，達到高抗水平。
　　2.解毒代謝酶與綠盲蝽對毒死蜱抗性的關(guān)系
　　測定了綠盲蝽品系(BZ-R、BZ、SLF)酯酶(EST)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)及多功能氧化酶(MFO)的活性并進行了活體增效實驗。結(jié)果顯示，BZ-R品系EST、GST和MFO的活力分別是SLF敏感品系的1.7、1.

5、6和0.8倍，但兩品系代謝酶活性間的差異未達到顯著水平;在BZ-R品系中，DEF、DEM和PBO對毒死蜱的增效作用分別為0.7、1.2和1.1倍，增效作用不明顯。上述結(jié)果表明，EST、GST和MFO的解毒代謝活性與BZ-R品系對毒死蜱的抗性不相關(guān)。
　　3.乙酰膽堿酯酶與綠盲蝽對毒死蜱抗性的關(guān)系
　　測定了BZ-R、BZ和SLF品系乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性及動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，BZ-R品系的AChE活力顯著降低，低于

6、SLF品系的1/2; BZ-R抗性品系A(chǔ)ChE動力學(xué)參數(shù)也發(fā)生了顯著改變，其Km值為SLF品系的3倍，Vmax值為SLF品系的1/3，說明在BZ-R品系中，AChE與底物的親和力降低、反應(yīng)速度下降。上述結(jié)果表明BZ-R品系中的AChE在質(zhì)上可能發(fā)生了改變，此改變與綠盲蝽對毒死蜱的抗性相關(guān)。
　　為了明確靶標突變在毒死蜱抗性中的作用，克隆了綠盲蝽的ace1全長基因。ace1基因開放閱讀框長為1791bp，編碼596個氨基酸，具有乙酰

7、膽堿酯酶家族所有的特征結(jié)構(gòu)，如催化三聯(lián)體、氧陰離子洞及氯離子結(jié)合位點等。綠盲蝽ace1基因與已克隆的黑肩綠盲蝽（Cyrtorhinus lividipennis）ace1基因的相似性達到90％。
　　對BZ-R、BZ、SLF品系中ace1基因mRNA表達量進行了檢測，結(jié)果顯示3個品系ace1基因的相對表達量分別為1.17，1.95，1.0，彼此間無顯著差異，表明ace1基因的表達量與綠盲蝽對毒死蜱的抗性無關(guān)。對3個品系A(chǔ)ChE氨基

8、酸序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，綠盲蝽ace1基因中存在A216S突變，該突變位于AChE重要的氧陰離子洞上，且靠近催化三聯(lián)體之一的Ser，是由于ace1基因第646位上堿基G突變?yōu)門所致;利用PCR產(chǎn)物直接測序法檢測到在SLF、BZ、BZ-R品系中ace1基因A216S的突變頻率分別為0.21、0.34和1.0，突變頻率隨綠盲蝽對毒死蜱抗性水平的升高而升高。上述結(jié)果表明，綠盲蝽ace1基因A216S突變可能導(dǎo)致AChE高級構(gòu)象發(fā)生改變，從而降低