胞壁酰二肽-抗CD10偶聯(lián)物體外刺激記憶T淋巴細(xì)胞活化的研究.pdf

1、目的：
　　探討免疫偶聯(lián)物胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）-抗CD10偶聯(lián)物（MDP-Antibody,MDP-Ab）對(duì)已接種卡介苗的健康兒童外周血中記憶性T淋巴細(xì)胞活化的影響。
　　方法：
　　1、采用Ficoll-Hypaque法分離獲得健康兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclearcell，PBMC），10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，分為3

2、組：對(duì)照組（PBMC1×106/mL+抗人CD28單克隆抗體0.5μg/mL）、MDP-Ab組（抗人CD28單克隆抗體+MDP-Ab20μg/mL）、卡介苗（bacillus calmette-guerin,BCG）組（抗人CD28單克隆抗體+BCG20μg/mL），光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài)；分別于0、12、24、48、72小時(shí)收集細(xì)胞上清液，ELISA方法檢測(cè)上清液中干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）水平。

3、
　　2、采集健康兒童外周血與RPMI-1640培養(yǎng)液等體積稀釋?zhuān)譃?組：對(duì)照組、MDP-Ab組、BCG組及PHA組（抗人CD28單克隆抗體+PHA20μg/mL），48小時(shí)后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD4、CD45RA、CD69及胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞形態(tài)：與對(duì)照組相比，培養(yǎng)24小時(shí)后MDP-Ab組及BCG組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞聚集，細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞形態(tài)可辨別。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)

4、細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量均增多，以BCG組最為明顯。
　　2、IFN-γ水平：對(duì)照組在0、12、24、48、72小時(shí)細(xì)胞上清液中IFN-γ水平分別為（401.76±17.10）pg/ml、（374.64±24.30）pg/ml、（376.53±28.96）pg/ml、（380.02±29.15） pg/ml、（390.17±33.64）pg/ml，MDP-Ab組在不同培養(yǎng)時(shí)間下細(xì)胞上清液中IFN-γ水平分別為（402.04±23.22）pg/

5、ml、（421.49±24.09）pg/ml、（456.76±41.99）pg/ml、（479.81±21.43）pg/ml、（449.10±13.66）pg/ml。兩因素重復(fù)測(cè)量資料的方差分析顯示，MDP-Ab刺激后IFN-γ的水平明顯高于對(duì)照組（F刺激=13.19，p=0.02），而培養(yǎng)時(shí)間對(duì)IFN-γ的水平無(wú)顯著影響（F時(shí)間=1.65，p=0.21）；處理因素與培養(yǎng)時(shí)間之間存在交互作用（F交互=3.51，p=0.03）；對(duì)不同時(shí)間

6、點(diǎn)兩組間IFN-γ的水平進(jìn)行t檢驗(yàn)，MDP-Ab組IFN-γ水平在12h、24h、48h均顯著高于對(duì)照組（p均＜0.05）。BCG組在不同培養(yǎng)時(shí)間下細(xì)胞上清液中IFN-γ水平分別為（405.34±30.48）pg/ml、（404.98.70±37.08） pg/ml、（444.33±22.94）pg/ml、（502.20±15.52）pg/ml、（517.84±21.54）pg/ml， 兩因素重復(fù)測(cè)量資料的方差分析顯示，BCG

7、組IFN-γ的水平明顯高于對(duì)照組（F刺激=5.49，p=0.00），且培養(yǎng)時(shí)間對(duì)IFN-γ水的水平有顯著影響（F時(shí)間=26.60，p=0.00），處理因素與培養(yǎng)時(shí)間之間存在交互作用（F交互=5.49，p=0.00）；對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)兩組間IFN-γ的水平進(jìn)行t檢驗(yàn)，BCG組IFN-γ水平在24h、48h、72h均顯著高于對(duì)照組（p均＜0.05）。
　　3、記憶T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)情況：CD3+CD4+CD45RA-IFN-γ+

8、細(xì)胞比例：對(duì)照組、MDP-Ab組、BCG組、PHA組分別為（0.010±0.017）%、（0.61±0.20）%、（1.05±0.45）%、（0.27±0.19）%。與對(duì)照組相比，MDP-Ab組的CD3+CD4+CD45RA-IFN-γ+細(xì)胞比例明顯升高（t=5.183，p=0.034），而B(niǎo)CG組及PHA組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p均＞0.05）。各組表型為CD3+CD4-CD45RA-IFN-γ+的T淋巴細(xì)胞均很少甚至不表達(dá)。

9、r>　　4、記憶T淋巴細(xì)胞表面CD69表達(dá)情況：⑴ CD3+CD4+CD45RA-CD69+細(xì)胞比例：對(duì)照組、MDP-Ab組、BCG組、PHA組分別為（4.70±1.16）%、（8.99±2.75）%、（13.69±2.79）%、（8.44±3.25）%，MDP-Ab組及BCG組CD3+CD4+CD45RA-CD69+細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組（p均＜0.05），而PHA組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.938，p=0.179）；⑵ C

10、D3+CD4-CD45RA-CD69+細(xì)胞比例：對(duì)照組、MDP-Ab組、BCG組、PHA組分別為（1.41±0.31）%、（3.91±1.73）%、（6.76±3.28）%、（5.15±1.79）%，MDP-Ab組及BCG組CD3+CD4-CD45RA-CD69+細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組（p均＜0.05），而PHA組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=3.601，p=0.067）。⑶ CD3+CD4+CD45RA-CD69+與CD3+CD4-

11、CD45RA-CD69+細(xì)胞比例比較：MDP-Ab、BCG兩組CD3+CD4+CD45RA-CD69+細(xì)胞比例分別為（8.99±2.75）%、（13.69±2.79）%，而CD3+CD4-CD45RA-CD69+細(xì)胞比例為（3.91±1.73）%、（6.76±3,28）%，兩組CD4+活化的記憶性T細(xì)胞比例均明顯高于CD4-活化的記憶性T細(xì)胞比例（p均＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　MDP-Ab能夠體外刺激已接種卡介苗的健康