異型流感病毒感染相關(guān)T淋巴細(xì)胞增殖活性及IFn-γ陽性CD8+T淋巴細(xì)胞水平研究.pdf

1、目的:
　　 流行性感冒病毒(influenza virus)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常常感染人并導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，在人群中迅速傳播，成為威脅人類健康的常見病原體之一。由于流感病毒是分節(jié)段的RNA病毒，容易發(fā)生錯配的RNA依賴的RNA聚合酶和基因重組導(dǎo)致抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，尤其是表面糖蛋白抗原—血凝素(hemagglutinin, HA)最易發(fā)生變異，使流感在人群中不斷形成

2、流行。2009年A/H1N1型流感的爆發(fā)再次引起全球的關(guān)注。目前使用的抗流感疫苗只含幾種常見流行株，主要是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HA特異性中和抗體，只對所含型別有效，對預(yù)防變異株感染無效。世界衛(wèi)生組織根據(jù)每年流感流行情況，對疫苗組合進(jìn)行調(diào)整，而疫苗的研制常常滯后于流感病毒抗原的變異。所以，研發(fā)可以抵御所有流感病毒感染，減輕感染的嚴(yán)重性并且在爆發(fā)時限制疾病的傳播的“通用型”疫苗成為對科學(xué)界的挑戰(zhàn)。
　　 流感病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生以系統(tǒng)和局部抗體

3、反應(yīng)為代表的特異性體液免疫以及以特異性T細(xì)胞反應(yīng)為代表的細(xì)胞免疫，二者對宿主抗病毒感染都很重要。因為針對疫苗產(chǎn)生的特異性抗體，不能阻止已發(fā)生變異的流感病毒感染，研究人員開始考慮能否通過提高細(xì)胞免疫的方法，達(dá)到預(yù)防異型流感病毒感染的目的。哪種細(xì)胞免疫反應(yīng)在抗異型流感病毒免疫中起主要作用？其機(jī)制是什么？目前無統(tǒng)一的結(jié)論。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，異型流感病毒間存在部分交叉保護(hù)作用，而且IL-2可以提高異型流感病毒感染組的生存率。為探討其機(jī)制，本

4、研究重點研究異型流感病毒感染后T淋巴細(xì)胞增殖活性和IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞水平的變化。本實驗分為兩部分，一部分研究將同型和異型流感病毒感染小鼠進(jìn)行比較研究;另一部分，將應(yīng)用IL-2及未應(yīng)用IL-2的異型流感病毒感染小鼠進(jìn)行比較研究。希望能為制備“通用型”流感疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 一、病毒滴度測定
　　 將A/FM/47(H1N1)流感病毒株的病毒儲存液用PBS溶液進(jìn)行10倍等比稀釋(1

5、0-1-10-10)，把各稀釋液分別接種于9日齡雞胚尿囊腔中，33-35℃孵箱培養(yǎng)，根據(jù)Reed-Muench方法，計算雞胚半數(shù)感染量。
　　 二、動物分組
　　 雌性，6-8周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)分成實驗組和對照組
　　 (1)異型流感病毒感染研究
　　 實驗1組（同型免疫組）:用A/H1N1型流感病毒免疫，A/H1N1型流感病毒感染;實驗2組（異型免疫組）:用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，A/H

6、1N1型流感病毒感染;對照1組（未免疫感染對照組）:用PBS代替疫苗，A/H1N1型流感病毒感染;對照2組（空白對照組）:正常飼養(yǎng)，不做任何處置。
　　 (2)應(yīng)用IL-2后異型流感病毒感染研究
　　 實驗1組（異型免疫組）:用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，A/H1N1型流感病毒感染;實驗2組（異型免疫加強(qiáng)組）:用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，同時使用IL-2，最后進(jìn)行A/H1N1型流感病毒感染;對照1組（單純使用I

7、L-2組）:只用IL-2后感染A/H1N1型流感病毒;對照2組（未免疫感染對照組）:用PBS代替疫苗，感染A/H1N1型流感病毒;對照3組（空白對照組）:正常飼養(yǎng)，不做任何處置。
　　 三、免疫動物、
　　 用A/H1N1流感病毒或A/H5N1型流感病毒疫苗按上述分組參照文獻(xiàn)和說明書免疫動物。使用IL-2組，免疫的同時連續(xù)注射IL-2，0、1、2天。首次免疫三周后加強(qiáng)免疫一次，方法劑量同上。
　　 四、感染動物<

8、br>　　 加強(qiáng)免疫兩周后，按上述分組每只小鼠經(jīng)鼻腔感染A/H1N1型流感病毒。正常飲食飲水飼養(yǎng)，感染病毒后每天準(zhǔn)確稱量小鼠體重，觀察飲食飲水及精神狀態(tài)。
　　 五、MTT法測定T淋巴細(xì)胞增殖活性
　　 分別在感染前、感染后5天、7天取小鼠脾細(xì)胞，接種于96孔板，每個樣本做3個復(fù)孔，每板設(shè)置空白對照，濕潤環(huán)境下，37℃，5％CO,孵育68小時后進(jìn)行MTT實驗，570nm讀取A值。
　　 六、IFN-γ陽性CD3

9、+CD8+淋巴細(xì)胞的測定
　　 分別于感染前、感染后5天、7天、14天取小鼠脾細(xì)胞。用CD3e-PerCP、CD8a-PE進(jìn)行表面染色，然后向細(xì)胞懸液中加入IFN-γ-FITC進(jìn)行胞內(nèi)染色，最后在流式細(xì)胞儀上讀取數(shù)據(jù)。
　　 七、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。
　　 結(jié)果:
　　 一、感染病毒滴度測定根據(jù)Reed-Muench方法，計算EID50

10、為104.8
　　 二、異型流感病毒感染研究
　　 ①T淋巴細(xì)胞增殖活性
　　 1、實驗1組（同型免疫組）和實驗2組（異型免疫組）T淋巴細(xì)胞增殖活性在感染后5天、7天都高于對照1組（未免疫感染對照組），差別顯著(P＜0.05);但是實驗1組（同型免疫組）與實驗2組（異型免疫組）差別不顯著。
　　 2、實驗1組（同型免疫組）感染后7天的T淋巴細(xì)胞增殖活性高于感染前，(P＜0.05)。實驗2組（異型免疫組）感

11、染后5天、7天的T淋巴細(xì)胞增殖活性均高于感染前，且差異顯著(P＜0.05);同時，感染后7天的T淋巴細(xì)胞增殖活性高于感染后5天的，差異顯著(P＜0.05)。
　　 ②IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的測定
　　 (1)實驗2組（異型免疫組）IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的水平在感染后7天高于實驗1組（同型免疫組），差別顯著(P＜0.05)。實驗2組（異型免疫組）與對照1組（未免疫感染對照組）差別顯著(P＜0

12、.05)。
　　 (2)實驗2組（異型免疫組）IFN-γ陽性CD3℃D8+淋巴細(xì)胞的水平在感染后7天出現(xiàn)一個高峰值，與感染前和感染后5天、14天差別顯著(P＜0.05)。
　　 三、應(yīng)用IL-2后異型流感病毒感染研究
　　 ①T淋巴細(xì)胞增殖活性
　　 (1)實驗1組（異型免疫組）和實驗2組（異型免疫加強(qiáng)組）在感染后T淋巴細(xì)胞增殖活性增強(qiáng);實驗1組（異型免疫組）與對照1組（單純IL-2免疫組）、對照2組（未

13、免疫感染對照組）差別顯著(P＜0.05)。實驗2組（異型免疫加強(qiáng)組）與對照2組（未免疫感染對照組）差別顯著(P＜0.05)。
　　 (2)實驗1組（異型免疫組）感染后5天T淋巴細(xì)胞增殖活性較比感染前高(P＜0.05)，感染后7天繼續(xù)升高，與感染前和感染后5天均差別顯著(P＜0.05)。實驗2組（異型免疫加強(qiáng)組）趨勢與實驗1組相似。
　　 ②IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的測定
　　 (1)實驗1組（異型免

14、疫組）和實驗2組（異型免疫加強(qiáng)組）在感染后7天IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的水平均出現(xiàn)峰值。實驗2組（異型免疫加強(qiáng)組）與實驗1組差別顯著(P＜0.05)，與對照1組（單純IL-2免疫組）、對照2組（未免疫感染對照組）差別顯著(P＜0.05)。
　　 (2))實驗1組（異型免疫組）和實驗2組（異型免疫加強(qiáng)組）IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的水平在感染后7天出現(xiàn)一個高峰值，與感染前和感染后5天、14天差別顯著(P＜