胞壁酰二肽-抗CD10偶聯(lián)物免疫導(dǎo)向治療兒童急性B淋巴細胞性白血病的研究.pdf

1、第一部分，目的：靶向性治療是一種潛在的有效抗白血病治療方法,尤其在清除微小殘留病、防止腫瘤復(fù)發(fā)方面發(fā)揮重要作用。本文將CD10單克隆抗體(anti-CD10Mab)與胞壁酰二肽(MDP)連接合成新的免疫偶聯(lián)物(MDP-Ab),觀察免疫偶聯(lián)物中Mab及MDP各自的生物活性。
　　 方法：(1)MDP-Ab制備:采用化學(xué)合成方法將CD10單克隆抗體(anti-CD10Mab)與胞壁酰二肽(MDP)連接合成新的免疫偶聯(lián)物(MDP-Ab

2、),硅膠柱及SephacrylS-100凝膠柱分離純化合成過程產(chǎn)生的各產(chǎn)物(PDP-arm-Boc、PDP-arm、PDP-MDP、IT-Ab及MDP-Ab);氫離子質(zhì)譜儀、電噴霧電離質(zhì)譜儀與紫外分光光度計分析合成中各產(chǎn)物的分子量(結(jié)果表達方式為MW+[H])及MDP-Ab中各分子比。以半胱氨酸標準曲線為準,采用Ellman's試劑分析IT-Ab中巰基數(shù)量;(2)MDP-Ab中抗體活性檢測:分離收集CD10+急性淋巴細胞性白血病細胞(陽

3、性率≥95%),加入MDP-Ab共同孵育,采用間接流式細胞術(shù)檢測MDP-Ab與CD10+細胞結(jié)合能力,以未偶聯(lián)的抗CD10抗體作對照。(3)MDP-Ab中MDP活性檢測:采用Ficoll-Hypaque法分離急性淋巴細胞性白血病患兒外周血單個核細胞,貼壁3h,懸浮細胞經(jīng)尼龍膜柱篩選獲得T淋巴細胞,凍存?zhèn)溆谩Ｈ≠N壁細胞分為6組,分別為:對照組(rhGM-CSF+rhIL-4)、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組(rhGM-CSF+rhIL-4+an

4、ti-CD10)、未偶聯(lián)的MDP組(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP)、MDP-Ab組(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP-Ab)、脂多糖(LPS)組(rhGM-CSF+rhIL-4+LPS)及MDP-Ab+LPS組(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP-Ab+LPS),培養(yǎng)8天,收集各組樹突狀細胞(DC),檢測細胞免疫表型、內(nèi)吞作用及細胞上清液中白介素12(IL-12)水平。將絲裂霉素C處理過的Dc與急性淋巴細胞性白血病患

5、兒同體的淋巴細胞按1∶10比例混合培養(yǎng)72h,CFSE染色法檢測各組淋巴細胞增殖情況,ELISA方法檢測上清液IFN-γ水平。
　　 結(jié)果：(1)氫離子質(zhì)譜顯示PDP-arm-Boc、PDP-arm、PDP-MDP的分子量結(jié)果(MW+[H])分別為372.1,272.1,746.4:根據(jù)半胱氨酸標準曲線,顯示IT-Ab中巰基數(shù)量為4.5;電噴霧電離質(zhì)譜與紫外線吸光度結(jié)果顯示免疫偶聯(lián)物中MDP-Ab分子量約為101KD,其中MDP

6、與Ab分子比為2∶1。(2)間接流式細胞術(shù)結(jié)果示MDP-Ab結(jié)合CD10抗原的陽性率為94.69%,與未偶聯(lián)的抗CD10抗體相比,無顯著性差異(p＞0.05)。(3)DC細胞免疫表型:MDP-Ab促進白血病患兒外周血DC表達HLA-DR、共刺激分子(CD80、CD86)及成熟分子(CD83)的陽性細胞均明顯高于對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MDP組,但低于LPS組及MDP-Ab+LPS組(F=629.619,p=0.000)

7、;(4)IL-12水平:對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MDP組分別為(42.37±5.83)pg/ml,(54.41±4.35)pg/ml,(60.75±5.06)pg/ml,而MDP-Ab組(80.63±3.73)pg/ml,LPS組(160.15±11.43)pg/ml,MDP-Ab+LPS組(190.33±6.61)pg/ml,明顯高于對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MDP組(F=857.872,p=0.00

8、0)。MDP-Ab組與LPS組、MDP-Ab+LPS組相比,亦有顯著性差異(p＜0.05);(5)DC吞噬功能:對照組(即未成熟DC)為(81.3±10.1)%,而未偶聯(lián)的抗CD10抗體組、未偶聯(lián)的MDP組、MDP-Ab組、LPS及MDP-Ab+LPS組分別為(66.7±9.78)%,(62.5±6.72)%,(41.6±5.67)%,(33.9±3.42)%,(25.6±3.68)%,與對照組相比,有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(F=383.04

9、,p=0.000)。(6)混合淋巴細胞反應(yīng):與對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MOP組相比,MDP-Ab組、LPS組及MDP-Ab+LPS組陽性細胞明顯增高,以MDP-Ab+LPS組為最高(F=393.36,p=0.000);(7)IFN-γ水平:對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MDP組分別為(67.72±3.94)pg/ml、(84.65±4.41)pg/ml、(89.69±3.02)pg/ml,而MDP-Ab組為

10、(173.06±8.14)pg/ml,LPS組為(209.24±9.43)pg/ml,MDP-Ab+LPS組為(356.17±9.48)pg/ml。MDP-Ab組明顯高于對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MDP組,而低于LPS組及MDP-Ab+LPS組(F=2497.18,p=0.000),且以MDP-Ab+LPS組水平最高。
　　 結(jié)論：1、成功采用化學(xué)方法合成新免疫偶聯(lián)物MDP-Ab。
　　 2、MDP-Ab

11、保持抗體特異結(jié)合抗原的活性,提示MDP-Ab具有靶向結(jié)合CD10+細胞能力。
　　 3、MDP-Ab能促進白血病患兒外周血樹突狀細胞表達高水平HLA-DR、共刺激分子(CD80/CD86)及CD83,分泌高水平IL-12,與細胞因子、脂多糖聯(lián)合作用最強。
　　 4、MDP-Ab誘導(dǎo)的樹突狀細胞能促進同體淋巴細胞增殖,分泌高水平IFN-γ分子,與細胞因子、脂多糖聯(lián)合作用最強,提示MDP-Ab保持促進樹突狀細胞增殖及成熟活性

12、。
　　 第二部分，目的：探討胞壁酰二肽-抗CD10偶聯(lián)物激活淋巴細胞的功能及其對裸鼠白血病移植瘤的殺傷作用。
　　 方法：采用Ficoll-Hypaque法分離急性淋巴細胞性白血病(ALL)患兒外周血單個核細胞,貼壁3h,取貼壁細胞分為6組,分別為:對照組(rhGM-CSF+rhIL-4)、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組(rhGM-CSF+rhIL-4+anti-CD10)、未偶聯(lián)的MDP組(rhGM-CSF+rhIL-4+

13、MDP)、MDP-Ab組(rhGM-CSF4-rhIL-4+MDP-Ab)、LPS組(rhGM-CSF+rhIL-4+LPS)及MDP-Ab+LPS組(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP-Ab+LPS)。采用反復(fù)凍融方法制備Nalm-6白血病細胞抗原,于DC誘導(dǎo)培養(yǎng)第4天加入且共同培養(yǎng),隔日換液,繼續(xù)培養(yǎng)。第8天,收集各組DC。經(jīng)Nalm-6抗原致敏、絲裂霉素C處理過的DC與培養(yǎng)第7天的ALL患兒同體T淋巴細胞按1∶10比例混合培養(yǎng)

14、48h,加入Nalm-6細胞(效應(yīng)細胞:靶細胞=10∶1)共培育12h,乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測各組T淋巴細胞的殺傷活性。將36只4周齡的雄性BALB/C裸鼠皮下接種1×107個/0.2毫升Nalm-6白血病細胞,第7～10天可形成皮下結(jié)節(jié)的白血病裸鼠模型,隨機分為6組(每組6只),移植瘤內(nèi)分別接種上述各組淋巴細胞,每周1次,共2次,于給藥第14天處死裸鼠。觀察各組腫瘤體積變化,繪制腫瘤生長曲線,計算腫瘤體積變化率;HE染色觀察腫

15、瘤、肝脾組織變化。
　　 結(jié)果：(1)T淋巴細胞殺傷活性:MDP-Ab組殺傷率為(35.66±5.81)%,明顯高于對照組(7.29±2.42)%、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組(13.83±2.90)%及未偶聯(lián)的MDP組(15.16±3.10)%,而低于LPS組(51.33±6.41)%及MDP-Ab+LPS組(63.33±6.92)%,以MDP-Ab+LPS組殺傷活性最強;(2)移植瘤生長:裸鼠皮下成瘤率可達100%,給藥前,所有

16、裸鼠腫瘤體積無顯著性差異;給藥后,MDP-Ab組腫瘤體積大小均明顯小于對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MDP組,但大于LPS組及MDP-Ab+LPS組,且以MDP-Ab+LPS組體積變化最小;(3)各組腫瘤體積變化率:對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MDP組第14天腫瘤體積變化分別為147.75,114.90,117.36,而MDP-Ab組為47.66,LPS組為32.31及MDP-Ab+LPS組為12.43,明顯低

17、于對照組、未偶聯(lián)的抗CD10抗體組及未偶聯(lián)的MDP組;(4)腫瘤肉眼及鏡下形態(tài)學(xué)變化:腫瘤早期表現(xiàn)為皮下瘤節(jié),呈圓形或橢圓形,后期表面凹凸不平呈多個結(jié)節(jié)融合,對照組3只裸鼠出現(xiàn)腫瘤非藥物注射部分破潰,甚至糜爛。剝離瘤體時,與皮下組織分界比較清楚,粘連較少,質(zhì)地堅硬,瘤體剖面血管豐富;光學(xué)顯微鏡下觀察,對照組腫瘤細胞大小不一,排列紊亂,以多角形或圓形多見,排列紊亂,多見分裂相;而MDP-Ab組、LPS組及MDP-Ab+LPS組顯微鏡下可見

18、不同程度的核固縮、碎裂及溶解、胞漿空泡現(xiàn)象,以MDP-Ab+LPS組最明顯。所有組裸鼠的肝脾均未見Nalm-6細胞浸潤。
　　 結(jié)論：1、MDP-抗CD10偶聯(lián)物誘導(dǎo)的致敏DC體外能提高同體T淋巴細胞的殺傷活性,與LPS共同作用時效應(yīng)最強。
　　 2、MDP-抗CD10偶聯(lián)物誘導(dǎo)的致敏DC能促進同體T淋巴細胞發(fā)揮體內(nèi)抑制腫瘤生長作用,且與LPS具有協(xié)同作用。
　　 3、成功建立Nalm-6白血病裸鼠模型,無全身轉(zhuǎn)