磁性瓊脂糖微球固定化豬肺血管緊張素轉(zhuǎn)化酶分離長蛇鯔降血壓肽的研究.pdf

1、食物蛋白源降血壓肽——血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽因其具有作用持久、安全、無毒副作用等優(yōu)點，可做為功能食品替代部分藥物起到降血壓輔助治療作用。將磁性分離技術(shù)與傳統(tǒng)分離方法相結(jié)合，可實現(xiàn)ACE抑制肽的快速分離純化。本文以瓊脂糖和Fe3O4為原料，采用反相微乳包埋法制備磁性瓊脂糖微球，將其做為載體，制備磁性親和介質(zhì)，用于長蛇鯔酶解液中ACE抑制肽的分離，經(jīng)反相高效液相色譜(RP-HPLC)進一步純化后，得到一個新的ACE抑制肽，并對其作

2、用機理進行了初步研究。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)采用反相微乳包埋法制備磁性瓊脂糖微球(MAMs)。以瓊脂糖和自制Fe3O4磁流體為原料，采用反相微乳包埋法制備磁性瓊脂糖微球，以微球平均粒徑做為考察指標(biāo)，用單因素實驗優(yōu)化磁性微球的制備工藝條件。用掃描電子顯微鏡(SEM)、傅立葉紅外光譜儀(FTIR)、熱重分析儀(TG)以及振動磁強計(VSM)對微球的性能進行表征。實驗結(jié)果表明，當(dāng)瓊脂糖濃度為25.0g·L-1，水油比W/O

3、為1∶10，Span80濃度為40.0 g·L-1，乳化溫度為80℃，攪拌速度為900 r·min-1，F(xiàn)e3O4濃度為4.5g·L-1時，制備的磁性瓊脂糖微球平均粒徑為10.69μm，具有良好是分散性，F(xiàn)e3O4含量為29.5％，磁飽和強度為5.67 emu·g-1，微球具有超順磁性，在外加磁場的作用下可快速實現(xiàn)固液分離。
　　(2)以環(huán)氧氯丙烷為活化劑對微球進行活化。以環(huán)氧基密度為考察指標(biāo)，采用單因素實驗優(yōu)化活化工藝條件。結(jié)果

4、表明，在NaOH溶液濃度為0.9mol·L-1，環(huán)氧氯丙烷體積分數(shù)為40.0％，NaBH4的濃度為0.5 g·L-1，活化溫度為40℃，活化時間為4h時，磁性瓊脂糖微球表面的環(huán)氧基密度最高，達到123.96μmol·g-1。
　　(3)以磁性瓊脂糖微球作為載體，亞氨基二乙酸(IDA)為連接臂，將Zn2+固定到已活化的磁性瓊脂糖微球上，制備磁性固定化金屬親和介質(zhì)MAMs-IDA-Zn2+。以Zn2+螯合量為考察指標(biāo)，通過單因素實驗優(yōu)

5、化制備工藝條件，在IDA接合時間為8h、IDA濃度為0.8 mol·L-1、Zn2+螯合時間為60 min，Zn2+濃度為0.03 mol·L-1的條件下，Zn2+螯合量達到最大值101.69μmol·g-1。
　　(4)采用磁性固定化金屬親和層析法對豬肺ACE進行分離純化。以蛋白吸附量為考察指標(biāo)，采用單因素實驗優(yōu)化吸附條件。在蛋白濃度為3.0mg·mL-1，NaCl濃度為0.5 mol·L-1，吸附時間為20 min，pH值8.

6、3的條件下，ACE全部吸附到MAMs-IDA-Zn2+上，吸附的蛋白ACE比活為0.037 U·mg-1。在NH4Cl濃度為1.0 mol·L-1，pH值7.8，洗脫時間為40 min的條件下，可將吸附的ACE洗脫下來，得到的ACE比活為0.160 U·mg-1，純化倍數(shù)為14.3，酶活回收率為65.8％。
　　(5)采用共價結(jié)合法將豬肺粗提ACE固定到活化的磁性瓊脂糖微球上，制備磁性固定化ACE(MAMs-ACE)。以MAMs-

7、ACE的比活為考察指標(biāo)，采用單因素實驗對制備工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，在蛋白濃度為8.0mg·mL-1、時間為2h、溫度為50℃、pH值7.8的條件下，得到的MAMs-ACE活力最高，達到0.128 U·g-1。同時，還對MAMs-ACE的性質(zhì)進行了研究，MAMs-ACE的最適pH值為7.8，最適溫度為42℃，比游離ACE具有更好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性;重復(fù)使用10次后，MAMs-ACE活力仍保持53.0％，具有良好的操作穩(wěn)定性;MA

8、Ms-ACE在-20℃條件下保存30天后，仍保持90.3％的酶活，而游離酶只保留了43.0％，說明MAMs-ACE具有更好的儲存穩(wěn)定性。對ACE的米氏常數(shù)Km進行測定，發(fā)現(xiàn)MAMs-ACE的Km相對游離ACE變小，說明ACE的固定化有利于酶與底物的結(jié)合。
　　(6)對MAMs-ACE的吸附性能進行研究。以ACE抑制肽HLPLP為特異性吸附模版蛋白，研究MAMs-ACE的特異性吸附性能。結(jié)果表明，在HLPLP濃度為4.0 mg·mL

9、-1，吸附時間為30 min，NaCl濃度為0.3 mol·L-1，pH值為7.8的條件下，特異性吸附量達到最大值22.77 mg·g-1。以牛血清白蛋白(BSA)為非特異性吸附的模版蛋白，在相同實驗條件下確定MAMs-ACE的最大非特異性吸附量為2.46 mg·g-1，是特異性吸附量的10.8％，說明MAMs-ACE具有良好的特異性吸附，可用于ACE抑制肽的分離純化。
　　(7)將MAMs-ACE做為磁性親和介質(zhì)，用于長蛇鯔酶解

10、液中ACE抑制肽的分離純化。以蛋白吸附量為考察指標(biāo)，通過單因素實驗優(yōu)化吸附工藝條件，在蛋白濃度為8.0 mg·mL-1，吸附時間為45 min，NaCl濃度為0.2mol·L-1，pH值為7.8的條件下，MAMs-ACE對蛋白的吸附量達到最大值29.50 mg·g-1。用2.0 mol·L-1 NaCl溶液反復(fù)洗脫8次，每次30 min，可將90.0％的蛋白洗脫下來。MAMs-ACE的吸附量隨重復(fù)使用次數(shù)的增加而降低，最多只能重復(fù)使用4

11、次。用RP-HPLC對親和純化的多肽進一步分離，得到單一的活性組分，質(zhì)譜儀解析得到該組分的氨基酸序列為:Gly-Met-Lys-Cys-Ala-Phe(GMKCAF), IC50為45.7μmol·L-1。
　　(8)采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法對GMKCAF(GF-6)的抑制類型進行研究，確定GF-6屬于非競爭性抑制劑。分別用初始速率法和等溫滴定量熱法(ITC)對測定ACE米氏常數(shù)Km，對結(jié)果進行比較。初始速率

12、法和ITC法測得的Km分別為0.327 mmol·L-1和0.347 mmol·L-1，說明ITC測定的結(jié)果是可信的。
　　(9)采用ITC對captopril和GF-6的抑制熱力學(xué)進行研究。通過ITC實驗得到了captopril和GF-6與ACE結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù):結(jié)合常數(shù)Ka、化學(xué)計量數(shù)n、ΔH、ΔCp和ΔG。結(jié)果表明，captopril和GF-6與ACE的結(jié)合反應(yīng)都是自發(fā)進行的吸熱過程，captopril以1∶1的比例與A