殼聚糖固定化血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的制備及其應(yīng)用.pdf

1、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallilrein-kinin system)中起著重要的作用。其能催化水解血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為具有強升壓作用的血管緊張素Ⅱ，同時也能使血管活性多肽緩激肽失活，從而導致血壓升高。抑制ACE的活性對降低血壓有著積極的作用。目前，ACE抑制劑(ACEI)已成為

2、治療高血壓的重要藥物。但合成ACEI副作用較大，因此，近年來的研究都致力于開發(fā)新型、低毒副作用、安全天然的ACEI，并將ACEI的來源鎖定于各種食物、動物、植物、中藥等。其中，中藥治療高血壓的有效性毋容置疑，目前已有70多種中藥被用于治療高血壓，中藥已成為一個重要的ACEI庫，潛隱于其中的新型ACEI有待發(fā)現(xiàn)。但中藥成分復雜，ACEI快速篩選方法的建立及優(yōu)化是研發(fā)新型降壓藥物的關(guān)鍵與難點。
　　 深入了解ACE的理化性質(zhì)，測定A

3、CE體外活性及抑制活性等研究中需要使用大量的ACE，但ACE純化過程復雜，商品化ACE價格昂貴，且游離ACE容易失活難以貯存。選用合適的方法將ACE固定于適宜載體上，能在保持ACE催化特性的同時，有效提高ACE的穩(wěn)定性及重復利用率。另外，固定化完成后，還可以通過對其進行進一步的物理、化學處理，用以改進固定化ACE的活力及穩(wěn)定性。得到的性能良好的固定化ACE，可作為親和吸附介質(zhì)或親和色譜填料用于ACEI的高通量快速篩選。
　　 本

4、文就ACE固定化方法及固定化載體制備，固定化ACE的活性調(diào)節(jié)及在ACEI篩選中的應(yīng)用、復雜體系A(chǔ)CE抑制活性快速檢測方法、中藥復方和單味中藥對ACE抑制活性及相互關(guān)系等方面做了以下的研究：
　　 (1)分別使用交聯(lián)、吸附的方法將ACE固定于交聯(lián)殼聚糖珠(CCB)及胺處理交聯(lián)殼聚糖珠(MCB)上，比較了不同固定化方法對固定化ACE比活力及活性表現(xiàn)率的影響?？疾炝私宦?lián)殼聚糖珠固定化ACE(CCB-ACE)及胺處理交聯(lián)殼聚糖珠固定化A

5、CE(MCB-ACE)的最適酶促反應(yīng)pH及溫度、Km、Vmax、穩(wěn)定性及重復利用性等性質(zhì)。結(jié)果表明：MCB-ACE的比活力、活力表現(xiàn)率、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、重復利用性及貯存穩(wěn)定性均優(yōu)于CCB-ACE；但由于吸附固定化的作用力較弱，MCB-ACE上的酶較CCB-ACE更易泄漏，但泄漏量低。綜合來看，以吸附法將ACE固定于MCB上是固定化ACE的一種較好的可行方法。
　　 (2)以戊二醛交聯(lián)殼聚糖珠為載體制備固定化ACE(CCB-

6、ACE)，CCB-ACE的活性及穩(wěn)定性雖低于MCB-ACE，但載體與酶結(jié)合的更牢固。本章將烷基胺(甲胺、乙胺、正丁胺、二乙胺、三乙胺)作為載體表面殘余醛基的淬滅劑，對CCB-ACE進行“后處理”，以此來改善CCB-ACE的活性及穩(wěn)定性。實驗對烷基胺的“后處理”條件進行了優(yōu)化，比較了處理前、后CCB-ACE的活性、酶動力學參數(shù)、最適pH及溫度、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、重復利用性及貯存穩(wěn)定性等性質(zhì)。結(jié)果表明，在最佳條件下，經(jīng)2240mM甲胺處

7、理后，CCB-ACE的活性增大了2-4倍；載體表面殘余醛基淬滅后，載體表面呈惰性，改善了固定化ACE所處微環(huán)境，從而CCB-ACE穩(wěn)定性也得到了很大提高；處理后的CCB-ACE的表觀米氏常數(shù)Km從4.33mM降至2.61mM，證明處理后CCB-ACE與底物親和力也得以增強。
　　 (3)在前一章中烷基胺已被證實能通過淬滅CCB-ACE載體表面的殘余醛基有效提高CCB-ACE的活性及穩(wěn)定性。當CCB-ACE作為親和介質(zhì)時，載體表面

8、上的殘余醛基亦會引起非特異性吸附，從而導致抑制劑篩選中的假陽性結(jié)果。文章中將烷基胺作為非特異性吸附屏蔽劑，結(jié)合高效液相色譜方法考察了多種ACEI(卡托普利、賴諾普利、貝拉普利、培哚普利、福辛普利)在烷基胺處理前、后的CCB-ACE上的特異性及非特異性吸附情況，將中藥青蘭中的多種核苷成分作為篩選模型驗證了烷基胺對非特異性吸附的屏蔽效果。以甲胺處理后的CCB-ACE作為親和吸附介質(zhì)，使用“差異篩選”法從山楂提取物中篩選ACEI；結(jié)合篩選結(jié)果

9、指認了兩種具有ACE抑制活性的成分，分別為綠原酸、表兒茶素。兩者對ACE的IC50分別為2.98mM、7.65mM。這種使用固定化ACE對中藥復雜體系進行親和篩選的方法具有簡便、快速、高效、低消耗等優(yōu)點。烷基胺能有效屏蔽由載體表面殘余醛基引起的非特異性吸附，保證了篩選結(jié)果的準確性。
　　 (4)建立在線親和色譜法快速篩選ACEI系統(tǒng)的核心是制備高性能的固定化ACE酶柱。“整體式”酶柱與顆粒填充酶柱相比，具有柱床更均一，表面積更大

10、等優(yōu)點。本章利用殼聚糖酸溶堿不溶的原理，直接凝結(jié)法制備“整體式”殼聚糖柱；并利用凍凝膠法制備“整體式”殼聚糖柱及卵蛋白/殼聚糖柱。實驗優(yōu)化了三種“整體式”材料的制備條件，對其結(jié)構(gòu)及性能進行了表征、比較。將“整體式”卵蛋白/殼聚糖柱作為載體用于ACE固定化，優(yōu)化了固定化條件，并對固定化ACE的活性、最適酶促反應(yīng)pH及溫度、Km、Vmax、穩(wěn)定性及重復利用性等相關(guān)性質(zhì)進行了考察。結(jié)果證明，以凍凝膠法制備的“整體式”卵蛋白/殼聚糖柱是一種良好

11、的ACE固定化載體，其易于制備，具有滲透性好、高傳質(zhì)速率、高容量、易裝填等優(yōu)點，得到的固定化ACE比活力高。為建立在線親和色譜快速篩選ACEI的方法奠定了基礎(chǔ)。
　　 (5)本文在傳統(tǒng)ACE體外活性測定方法的基礎(chǔ)上，以豬肺ACE粗提物為酶源，馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)為底物，使用溶劑誘導相變萃取法(Solvent induced phase separation extraction，SIPSE)萃

12、取酶反應(yīng)產(chǎn)物馬尿酸(HA)，紫外分光光度法(UV)測定HA生成量，以評估ACE活性及樣品對ACE的抑制活性。以卡托普利為模型對本方法進行了驗證，并將本方法與傳統(tǒng)的乙酸乙酯萃取及HPLC法進行了對比，測定了幾種蔬菜汁及多種中藥提取物對ACE的抑制活性。結(jié)果表明，豬肺ACE粗提物即可滿足ACE抑制活性測定的需要；與傳統(tǒng)液液萃取法相比，SIPSE對HA具有更高選擇性及萃取能力，萃取率為97.47±0.55％(n=3)；通過計算校正，扣除基質(zhì)及

13、干擾成分對UV法測定的影響，SIPSE-UV法能用于測定成分復雜體系對ACE的抑制活性。
　　 (6)基于前一章建立的SIPSE-UV體外ACE抑制活性測定方法，測定了復方“天麻鉤藤飲”及組成其的11種單味藥的煎煮液對ACE的抑制活性。分析了復方及11種單味藥的HPLC-UV指紋譜圖差異。評估了11種單味藥對復方ACE活性的貢獻率，探討了復方與各單味藥間的相互作用。評估中藥對ACE抑制率及復方單味藥對總抑制率的“貢獻”大小，可以