烏賊墨多糖SIP-1干預(yù)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)小鼠卵巢細(xì)胞凋亡與自噬的研究.pdf

1、烏賊墨多糖(Squid ink polysaccharide, SIP)是從廢棄物烏賊墨囊中分離提取得到的具有諸多生物學(xué)功能的海洋生物活性物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)SIP對(duì)環(huán)磷酰胺(CP)致小鼠腎、肺、肝、睪丸、卵巢損傷具有保護(hù)作用。本文旨在探討烏賊墨多糖分離純化后的組分SIP-1的結(jié)構(gòu)及其干預(yù)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)卵巢細(xì)胞凋亡與自噬的機(jī)制。
　　本研究經(jīng)酶法提取、乙醇沉淀方法分離提取得到粗多糖，然后經(jīng)過DEAE-52纖維素柱層析和Sephacry

2、l S-300HR凝膠滲透色譜進(jìn)行分級(jí)純化，得到三個(gè)糖組成相對(duì)單一組分SIP-1、SIP-2、SIP-3，以SIP-1為研究對(duì)象，對(duì)其純度進(jìn)行測(cè)定。分離純化得到SIP-1經(jīng)紫外掃描顯示260nm及280nm處無吸收峰，說明SIP-1不含有核酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。通過高效液相色譜分析，結(jié)果顯示只有一個(gè)峰形較對(duì)稱且峰寬較窄的峰，說明組分SIP-1較純。
　　對(duì)SIP-1進(jìn)行初級(jí)結(jié)構(gòu)分析。紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果分析顯示SIP-1在波

3、數(shù)3385.96 cm-1處有很強(qiáng)O-H伸縮振動(dòng)和N-H伸縮振動(dòng)，在波數(shù)2931.23cm-1處有C-H伸縮振動(dòng)，1637.74cm-1處是氨基N-H變角振動(dòng)，1077cm-1和1034.21cm-1是多糖羧基中C-O伸縮振動(dòng)峰。將SIP-1進(jìn)行完全酸水解，利用高效液相色譜法進(jìn)行單糖組成分析，結(jié)果表明SIP-1含有氨基半乳糖(GaIN)、阿拉伯糖(Ara)，其摩爾比為1∶1。高碘酸氧化、Smith降解分析結(jié)果顯示SIP-1中可能存在1→

4、2、1→3、1→6類型的糖苷鍵。核磁共振1HNMR和13CNMR分析結(jié)果表明，SIP-1中單糖糖苷鍵和構(gòu)型可能為α-L-Arap存在1→5糖苷鍵，α-D-GalNp存在1→6糖苷鍵。
　　40只健康的昆明種雌性小白鼠，將其隨機(jī)分為4組:空白組、模型組、樣品對(duì)照組、治療組。15d后，測(cè)定小鼠體重、生殖器官重量及指數(shù)、卵巢組織病理學(xué)變化及血清激素水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CP對(duì)雌性小鼠卵巢具有毒性損傷作用，而SIP-1能緩解CP所致的卵巢生殖

5、損傷作用。與空白組相比，模型組卵巢重量、卵巢指數(shù)、子宮重量及子宮指數(shù)極顯著(P＜0.01)降低，小鼠體重顯著(P＜0.05)下降;光鏡下觀察可見卵巢組織中卵泡總數(shù)、各級(jí)卵泡數(shù)顯著減少，閉鎖卵泡增多;卵泡刺激素(FSH)、血清黃體生成素(LH)水平升高，雌激素水平(E2)降低。與模型組相比，SIP-1治療組對(duì)CP所致的各項(xiàng)指標(biāo)變化均有明顯的改善作用(P＜0.05或P＜0.01)。
　　40只健康的昆明種雌性小白鼠，對(duì)其分組處理如上。

6、15d后，處死小鼠，取雙側(cè)卵巢，通過透射電鏡分析卵巢超微結(jié)構(gòu)，TUNEL染色檢測(cè)卵巢細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)卵巢組織中與細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比，模型組在透射電鏡下可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器數(shù)量減少，存在凋亡小體;卵巢細(xì)胞的凋亡率極顯著升高(P＜0.01);Bax表達(dá)水平、p38磷酸化水平、LC3、Beclin1表達(dá)水平顯著提高(P＜0.05或P＜0.01)，Bcl-2、p-Akt表達(dá)水平顯著降低

7、(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組相比，SIP-1顯著改善CP所致卵巢的損傷，卵巢細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P＜0.05)，且SIP-1顯著緩解CP所致Bcl-2、p-AKT表達(dá)水平的降低(P＜0.05或P＜0.01)及p38磷酸化水平、LC3、Beclin1表達(dá)水平的升高(P＜0.05)。說明SIP-1可能通過調(diào)控與凋亡及自噬相關(guān)的蛋白的表達(dá)水平來緩解CP所致的卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡與自噬。
　　SIP-1是一種具有新穎結(jié)構(gòu)的純化