甲氨蝶呤聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)CIA小鼠Treg細(xì)胞影響的研究.pdf

1、目前，對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA)這種復(fù)雜的慢性自身免疫性疾病的治療，歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)對(duì)如何合理有效的運(yùn)用合成及生物的DMARDs藥物做出進(jìn)一步指導(dǎo)和推薦。DMARDs藥物主要分為傳統(tǒng)合成DMARDs藥物，比如甲氨蝶呤(MTX)、柳氮磺吡啶(SSZ)、來氟米特(LEF);在世界范圍內(nèi)，以甲氨蝶呤（methotrexate，MTX)聯(lián)合來氟米特（leflunomide，LEF)為主要代表

2、。經(jīng)我科10余年的臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究證實(shí)，周期特異性藥物MTX聯(lián)合周期非特異性藥物CTX治療RA優(yōu)于MTX聯(lián)合LEF，且毒副作用明顯減小。
　　盡管類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，但是研究表明，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞中輔助性T細(xì)胞17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例翻轉(zhuǎn)或者偏離正常。其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是發(fā)揮抑制自身免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要通過IL-2、TGF-P等細(xì)胞因子發(fā)揮抑制輔助性T細(xì)胞的作用，來達(dá)到糾正免疫不平衡的目的。本研究

3、主要明確周期運(yùn)用免疫抑制劑甲氨蝶呤和環(huán)磷腺苷能否對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠Treg細(xì)胞的影響。
　　研究目的
　　明確甲氨蝶呤周期聯(lián)合環(huán)磷腺苷作用于C I A小鼠后Treg細(xì)胞的影響。
　　研究方法
　　1.體內(nèi)試驗(yàn)
　　體內(nèi)試驗(yàn)：選取雄性DBA1小鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只和CIA組40只。建立CIA模型后根據(jù)擬用藥不同隨機(jī)分為4組：CIA組、MTX組（1.5 mg/kg/3d)、CTX組（30 mg/

4、kg/10d)和MTX+CTX組（聯(lián)合組，MTX:1.5mg/kg/3d，CTX:30mg/kg/
　　10d)。加強(qiáng)免疫3周后開始給藥，治療過程中連續(xù)監(jiān)測(cè)各組小鼠左踝關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index, AI)。給藥11周后處死小鼠，取雙膝、左踝關(guān)節(jié)切片，進(jìn)行HE染色，觀察病理改變。分選脾細(xì)胞中的Naive T細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞因子IL-2、TGF- P1、抗IL-4、抗IFN-y刺激于37℃5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中

5、培養(yǎng)96小時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)后Treg細(xì)胞所占比例。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　選取雄性的DBA1小鼠30只建立CIA模型，7周時(shí)處死，分選脾淋巴細(xì)胞中的NaiveT細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、抗CD3CD28激活組（激活組）、刺激Treg細(xì)胞定向分化組(定向分化組）、CTX組、低濃度MTX組（MTX低組）、中濃度MTX組（MTX中組）、高濃度MTX組（MTX高組）、MTX低+CTX組（低聯(lián)合組），在37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中

6、培養(yǎng)96小時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)后Treg細(xì)胞所占比例。
　　研究結(jié)果
　　1.治療前，各治療組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度、A I與C I A組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療4周后，各治療組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度、AI較CIA組改善明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療11周后，聯(lián)合組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度、AI較CIA組、CTX組改善明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合組較MTX組改善明顯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　2在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給藥

7、11周后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)后C IA組較正常對(duì)照組組小鼠脾臟Naive T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的所占比例與CIA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05);各治療組較CIA組Treg細(xì)胞所占比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05);聯(lián)合組較CTX、MTX單用藥組Treg細(xì)胞所占比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單用藥組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。
　　3.體外實(shí)驗(yàn):小劑量M T X聯(lián)合 CTX和小劑量MTX用