新型姜黃素納米顆粒的制備及其對高糖環(huán)境下GMCs作用機制研究.pdf

1、目的:
　　納米技術(shù)在過去幾十年中的快速發(fā)展，促進其在多個學(xué)科和領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，可以利用納米材料構(gòu)建藥物傳遞系統(tǒng)，應(yīng)用于疾病診斷甚至應(yīng)用于化妝品等。隨著醫(yī)學(xué)研究的進步和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善，再結(jié)合化學(xué)和物理材料學(xué)，以及基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，人們對疾病的預(yù)防、診斷和治療的方式有了更多的認識。由于納米具有微小性、多功能性、低成本以及高性能等特點，有利于作為藥物靶向傳遞的開發(fā)，可解決常規(guī)診治載體遇到的生物學(xué)屏障，免疫系

2、統(tǒng)屏障等，因此成為疾病診斷與治療中的新的高效選擇。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，包括牙科、腫瘤、免疫抗體制備等，均涉及納米材料的引入和應(yīng)用。納米顆粒（nanoparticles，NP）與傳統(tǒng)劑型比較，具有更多的優(yōu)勢，包括能夠提高藥物的生物利用度以及治療的靶向性，因此納米顆粒和納米治療成為眾多研究小組的熱點。
　　作為能夠具有較好的應(yīng)用價值的納米藥物載體要將藥物被運輸?shù)桨袇^(qū);不僅需要本身材料粒徑合適且大小均一，具備較好的生物相容性，可以包載足量藥物

3、，并且本身毒性低，對機體不會產(chǎn)生毒副作用，會降解，且可在體內(nèi)進行循環(huán)，以確定藥物能夠經(jīng)血液循環(huán)過程中通過毛細血管達到并蓄積于病灶組織;保證在治療靶區(qū)內(nèi)所有藥物的釋放過程達到有效治療濃度，促進藥物能夠釋放并作用于病變細胞，并介導(dǎo)細胞內(nèi)吞，同時不對正常細胞造成損傷。殼聚糖(chitosan，CS)又稱脫乙酰甲殼素，也叫甲殼胺或幾丁聚糖，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，與多聚磷酸鈉(tripolyphospha

4、te sodium，TPP)通過離子交聯(lián)方法可方便的制備殼聚糖納米顆粒(chitosan nanoparticles，CNPs)。殼聚糖容易獲得，費用低，具有良好生物相容性、可生物降解、毒性低、有效包載藥物且能保護在體內(nèi)不被酶破壞，因此成為了理想的高效納米藥物載體的選擇。磷脂酰絲氨酸，又稱復(fù)合神經(jīng)酸，Phosphatidylserine，簡稱PS，是一類普遍存在的磷脂，磷酯化合物中的磷酸甘油酯類，通常位于細胞膜的內(nèi)層，是細胞膜組分之一，

5、與一系列的膜功能有關(guān)。磷脂酰絲氨酸(PS)具有很強的親脂性，故在細胞周期信號的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。PS可被受體CD68、CD14、膜聯(lián)蛋白和β2糖蛋白Ⅰ、GAS6以及清道夫受體蛋白所識別。這些受體可以在PS包覆納米顆粒識別中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，可以有效的靶向治療。
　　姜黃素，又名姜黃色素，英文名Curcumin，簡稱CU，化學(xué)結(jié)構(gòu)為C21H20O6，分子量368.37，屬于小分子多酚類化合物。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認為，姜黃素具有多種藥理

6、活性，如:抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、消除自由基、抗炎、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗凝、抗衰老等。姜黃素的諸多藥理作用促進其在臨床領(lǐng)域的關(guān)注度增加，尤其姜黃素的抗氧化以及降血脂、抗心血管疾病、抗腫瘤、抗糖尿病作用更得到廣泛認可。有報道姜黃素可改善胰島β細胞功能，減少胰島素抵抗，從而預(yù)防糖尿病進展。但姜黃素的生物利用度很低，而且受環(huán)境因素的影響。當姜黃素在堿性環(huán)境中發(fā)生降解，導(dǎo)致其藥理作用降低，影響其臨床應(yīng)用。由于納米載體的本身粒徑非常小，利用

7、體內(nèi)循環(huán)，并延長作用時間，提高靶向部位藥物濃度，并可一定程度上增加藥物的水溶性和穩(wěn)定性，因此將姜黃素和納米技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用成為新的目標，為姜黃素輸送體系達到好的效果提供可能，以便于姜黃素在臨床上能夠得到更有效得應(yīng)用。
　　但也存在一定的問題，包括應(yīng)用納米載體給藥或者給藥劑量過高，高濃度的姜黃素會導(dǎo)致體內(nèi)活性氧(ROS)增加，引起氧化應(yīng)激，也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的因素之一。姜黃素和部分納米載體結(jié)合可導(dǎo)致細胞的DNA損傷，減少抑癌基因p53的活

8、性。因此采用合適的納米載體技術(shù)制備姜黃素納米顆粒，可提高抗氧化，抗心血管疾病以及抗腫瘤的臨床療效，具有良好的應(yīng)用前景。
　　糖尿病患者最嚴重的的并發(fā)癥之一是糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)。近年來中國DN的發(fā)病率逐年上升，目前僅次于各種腎小球腎炎，已然成為終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的第二位原因。由于DN復(fù)雜的致病機制和代謝紊亂，一旦患者進入到ESRD，其治療

9、通常比其他腎臟疾病更加困難和棘手。因此在延緩糖尿病腎病進展中，早期防治具有重大意義。
　　糖尿病腎病的發(fā)病機制尚不完全清楚。細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在系膜區(qū)堆積是DN的主要病理特征，腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cells，GMCs)是糖尿病腎病的靶細胞。發(fā)生糖尿病并發(fā)癥共同的病理生理基礎(chǔ)，目前認為是糖尿病患者高血糖所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(oxidative stress

10、，OS)。高糖進入腎小球系膜細胞后可引起系膜細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生增加，其機制是通過線粒體(mitochondria)途徑和激活NADPH氧化酶。故ROS是高糖的信號分子(signaling molecules)，經(jīng)MAPK及JAK信號通路(signaling pathway)，GMCs細胞內(nèi)的一系列轉(zhuǎn)錄因子，如核因子κB(NF-κB)、活性蛋白1(AP-1)被激活，繼而引起單核趨化

11、蛋白-1（MCP-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、PAI-1等細胞因子（cytokines）的表達上調(diào)，最終介導(dǎo)腎組織纖維化的發(fā)生。所以，如果能抑制系膜細胞內(nèi)由高糖誘導(dǎo)的ROS聚集將會有可能阻斷高糖所帶來的一系列病理效應(yīng)，其意義重大。
　　在本研究中成功制備了姜黃素殼聚糖納米顆粒(CNPs-CU)、磷脂酰絲氨酸修飾的姜黃素殼聚糖納米顆粒(PS-CNPs-CU)，分析PS-CNPs-CU、CNPs-CU的特征和性能。評估P

12、S-CNPs-CU、CNPs-CU和游離的姜黃素(CU)應(yīng)用對人胚腎細胞（HEK-293）的細胞毒性作用;進一步深入研究PS-CNPs-CU及CNPs-CU的遺傳毒性作用。并通過建立高糖環(huán)境下培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞(GMCs)，分析CU、CNPs-CU和PS-CNPs-CU對GMCs增殖的抑制作用以及相關(guān)機制的初步探討。
　　方法:
　　殼聚糖的游離氨基可與多聚磷酸鈉(TPP)的陰離子發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)，從而制備規(guī)格一致的空

13、白殼聚糖納米顆粒(blank CNPs)和姜黃素殼聚糖納米顆粒（CNPs-CU）。磷脂膜與分散的CNPs和CNPs-CU的水化而制備PS-CNPs和PS-CNPs-CU。CNPs-CU、PS-CNPs-CU、CNPs和PS-CNPs的納米顆粒直徑、多分散指數(shù)(PDI)采用Malvern Zetasizer2000檢測;Zeta電位采用Malvern Zetasizer激光多普勒測定。所有的納米顆粒用三蒸水(TDW)稀釋到適當?shù)臐舛?，儀器

14、在全自動模式進行測量。包封率(％EE)是計算包載在CNPs-CU、PS-CNPs-CU中的姜黃素(CU)藥物的含量。利用高分辨透射電鏡觀察PS-CNPs-CU納米顆粒的形態(tài)學(xué)。利用高效液相色譜(HPLC)儀測定CNPs-CU、PS-CNPs-CU中的姜黃素(CU)的累積釋放率。
　　結(jié)果:
　　1.CNPs和CNPs-CU的納米顆粒直徑分別是99.6±2.15nm和167.6±3.53nm。二者的粒度分布較窄，多分散指數(shù)(p

15、olydispersity index，PDI)都較低(＜0.2)，分別是0.072±0.02和0.115±0.014。二者的zeta電位是正電位，分別是19.9±1.27mV和21.9±1.31mV。
　　2.PS-CNPs和PS-CNPs-CU的納米顆粒直徑分別是176.7±2.21nm和220.5±3.67nm。二者的的粒度分布也較窄，PDI分別是0.124±0.016和0.148±0.019。二者的zeta電位則是負電位，

16、分別是-19.9±1.33mV和-25.4±2.13mV。
　　3.CNPs-CU包封率是(％EE)59.4±3.1％,而PS-CNPs-CU包封率(％EE)是50.4±3.7％。PS-CNPs-CU包封率低于CNPs-CU，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義
　　4.高分辨透射電鏡觀察分析:PS-CNPs-CU的形態(tài)學(xué)特征完全符合，納米顆粒呈球形，形態(tài)較規(guī)則，脂質(zhì)層作為連續(xù)的層面覆蓋CNPs。
　　結(jié)論:
　　1.通過水溶

17、性殼聚糖，利用離子交聯(lián)方法，并利用磷脂酰絲氨酸修飾，成功制備了姜黃素殼聚糖納米顆粒(CNPs-CU)和PS修飾姜黃素殼聚糖納米顆粒(PS-CNPs-CU)。
　　2.PS-CNPs-CU、CNPs-CU具有良好的緩控釋特性，進而為疾病治療研發(fā)新型納米顆粒提供新的方案和參考依據(jù)。
　　3.PS-CNPs-CU、CNPs-CU的細胞毒性和遺傳毒性低，作為藥物載體安全可靠。
　　4.姜黃素可通過調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎性因子