巴氏醋酸桿菌uvrA基因的敲除及對(duì)菌體醋酸耐受性的影響.pdf

1、醋酸是常見的有機(jī)酸之一，其廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。醋酸菌能氧化乙醇產(chǎn)醋酸，因?yàn)槠漭^高的醋酸生產(chǎn)能力和醋酸耐受能力而常用于醋酸發(fā)酵生產(chǎn)。本論文主要圍繞巴氏醋桿菌AC2005的核酸修復(fù)酶UvrA與菌體醋酸耐受性之間的關(guān)系進(jìn)行研究，利用基因工程的方法分別構(gòu)建巴氏醋桿菌AC2005 uvrA基因敲除菌株和重組表達(dá)菌株，研究UvrA對(duì)菌體生長(zhǎng)和醋酸發(fā)酵的影響，從而闡明UvrA與菌體醋酸耐受性之間的關(guān)系。研究將進(jìn)一步完善醋酸菌醋酸耐受機(jī)制，并指導(dǎo)

2、醋酸菌發(fā)酵菌株的選育，具有一定的應(yīng)用價(jià)值和科學(xué)意義。
　　醋酸對(duì)巴氏醋桿菌AC2005生長(zhǎng)具有抑制作用，在1％的醋酸濃度條件下，AC2005的延滯期從1h增加到8h。利用瓊脂糖凝膠電泳分析基因組完整性，發(fā)現(xiàn)隨著醋酸濃度的增加AC2005基因組完整性下降;分析了不同醋酸濃度條件下巴氏醋桿菌AC2005蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)醋酸存在條件下其核酸修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)量平均上調(diào)了54.8％。利用RT-PCR方法分析uvrA轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)菌體在1％

3、、2％醋酸濃度條件下，與對(duì)照相比，uvrA轉(zhuǎn)錄水平分別增加了146％和275％，說明醋酸會(huì)導(dǎo)致菌體基因組斷裂損失，此過程中醋酸菌會(huì)上調(diào)表達(dá)UvrA等核酸修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)蛋白，UvrA可能與其醋酸耐受性相關(guān)。
　　利用自殺質(zhì)粒pSUP202建立了巴氏醋桿菌AC2005基因敲除的方法，構(gòu)建了巴氏醋桿菌uvrA基因敲除載體pSUP202-uvrA-1∷Km，利用同源重組的原理構(gòu)建了巴氏醋桿菌AC2005 uvrA基因敲除菌株AC2005-Δ

4、uvrA;利用大腸桿菌和醋酸菌穿梭質(zhì)粒pMV24構(gòu)建uvrA基因重組表達(dá)質(zhì)粒pMV24-uvrA，獲得UvrA重組表達(dá)菌株AC2005(pMV24-uvrA)和對(duì)照菌株AC2005(pMV24)。
　　在初始添加1％、2％和3％的醋酸條件下分析了醋酸對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。與對(duì)照菌株AC2005(pMV24)相比，1％和2％醋酸條件下培養(yǎng)48h，AC2005-ΔuvrA的生物量分別下降了84.85％和47.13％，而AC2005(pMV

5、24-uvrA)的生物量分別提高了17.1％和24.2％;醋酸濃度3％條件下培養(yǎng)72 h，AC2005(pMV24)和AC2005-ΔuvrA生長(zhǎng)受到顯著抑制，基本不生長(zhǎng)，而AC2005(pMV24-uvrA)的生物量比對(duì)照提高了66.1％。分析了6％醋酸對(duì)菌體存活率的影響，6％的醋酸處理40 min，AC2005-ΔuvrA的存活率僅為2.56×10-5，而AC2005(pMV24-uvrA)的存活率是AC2005(pMV24)的大約

6、2倍。
　　利用含7％乙醇的醋酸發(fā)酵培養(yǎng)基比較了不同菌株的醋酸發(fā)酵情況，與對(duì)照AC2005(pMV24)相比，AC2005（pMV24-uvrA）的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，但最終產(chǎn)酸量比對(duì)照菌株提高大約10％;而AC2005-ΔuvrA生長(zhǎng)受到影響，發(fā)酵液中醋酸濃度達(dá)到0.45 g/100mL時(shí)其生物量和醋酸濃度開始下降。分析發(fā)酵過程乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)活性發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，AC2005-ΔuvrA中ADH和AL