DREB轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及其對非生物脅迫耐受性研究.pdf

1、本研究將從本塞姆氏(NicotianaBenthamiana)中分離克隆出的NbDREB1基因和從油菜中分離克隆的BnDREB1-5基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對烤煙K326品種和香料煙Basma、Izmir品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，研究了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草的各種影響因素，并對經(jīng)分子鑒定的轉(zhuǎn)基因煙株進(jìn)行了非生物逆境脅迫下的生物學(xué)特性分析，結(jié)果如下： 1.葉齡太長或太短，轉(zhuǎn)化率都不高，20d葉齡的葉片，轉(zhuǎn)化率最高；同一葉片，葉尖、葉中和葉基比較，葉中

2、的轉(zhuǎn)化率最高；預(yù)培養(yǎng)比不預(yù)培養(yǎng)有較高的轉(zhuǎn)化率，預(yù)培養(yǎng)64h，轉(zhuǎn)化率達(dá)93％：菌液濃度也影響轉(zhuǎn)化率，OD600值0.45左右的菌液濃度，轉(zhuǎn)化效果最好；暗培養(yǎng)3d，葉盤周圍出現(xiàn)輕微菌斑，轉(zhuǎn)化率最高。 2.轉(zhuǎn)基因和野生型煙株葉片分別點(diǎn)涂(100mg/L)Km液10μl，9d后觀察，野生型煙草葉片涂抹點(diǎn)葉色變黃，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片沒有變化。PCR檢測69株Km抗性煙株，37株為陽性。其中35S：NbDREB1(K326)5株，rd29A：

3、NbDREB1(K326)5株，rd29A：BnDREB1-5(Izmir)14株，35S:BnDREB1-5(Izmir)10株，35S：BnDREB1-5(Basma)3株，陽性轉(zhuǎn)化率為54％。 3.轉(zhuǎn)35S：BnDREB1-5基因的香料煙Basma品種表現(xiàn)出良好的保水性能，上表皮細(xì)胞的氣孔密度明顯少于野生型，且上表皮氣孔開度小于野生型。對離體煙草葉片進(jìn)行自然干旱脅迫7h后，野生型煙草葉片的相對電導(dǎo)率是轉(zhuǎn)基因煙草葉片的1.4

4、倍：轉(zhuǎn)基因煙草葉片中SOD活性比野生型煙草葉片高42％；且失水萎蔫后的復(fù)水速度快于野生型。對整體煙株進(jìn)行干旱脅迫6h后，轉(zhuǎn)rd29A：BnDREB1-5基因的香料煙Izmir品種葉片中脯氨酸含量和可溶性糖含量分別是野生型的3.55倍和2.33倍；高鹽脅迫6h后，轉(zhuǎn)基因煙株比野生型煙株的脯氨酸和可溶性糖含量高，但是差異不大，可能是處理時(shí)間短，達(dá)不到生理反應(yīng)的敏感程度。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)入增強(qiáng)了煙草的非生物脅迫耐受