超量表達(dá)GhGS1基因提高棉花對(duì)低氮脅迫的耐受性.pdf

1、氮素作為植物體內(nèi)不可缺少的化學(xué)元素之一，對(duì)眾多生理生化反應(yīng)有重大影響。它不僅是核酸、蛋白質(zhì)、磷脂及酶、輔酶和輔基如NAD+，NADP+，F(xiàn)AD等物質(zhì)的主要成分，還是一些維生素、植物激素及次生代謝中間產(chǎn)物的重要組成成分。除此之外，作為植物葉綠素的一個(gè)重要組成元素，氮素在很大程度上影響植物光合作用中光反應(yīng)和暗反應(yīng)諸多酶的活性。因此合理調(diào)控氮代謝相關(guān)基因?qū)⒂欣谧魑锷L發(fā)育。棉花是一種氮素敏感植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，需要大量施用氮肥來保證棉花產(chǎn)量

2、與品質(zhì)。但是作為棉花生產(chǎn)大國，大量施用氮肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境方面給我國帶來很多負(fù)面影響。如何解決棉花對(duì)氮肥需求大和減少環(huán)境污染這一突出矛盾，提高棉花氮素利用率是解決此矛盾的核心和關(guān)鍵。
　　谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase, GS）是植物體氮代謝途徑中進(jìn)行“GS-GOGAT”循環(huán)不可缺少的關(guān)鍵酶。它是首個(gè)將外界環(huán)境的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為植物體內(nèi)含氮有機(jī)物的酶。為了研究 GS基因在棉花生長過程中的作用，我們克隆了棉花谷氨

3、酰胺合成酶基因GhGS1，并構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行了棉花遺傳轉(zhuǎn)化，使之在棉花中超量表達(dá)，從而探究GhGS1基因?qū)γ藁ǖ乩寐实挠绊?。取得主要研究結(jié)果如下：
　　1.陸地棉GhGS1基因的克隆與進(jìn)化分析
　　首先從陸地棉中克隆了GhGS1基因（Gh_D07G1773），生物信息學(xué)分析顯示該基因位于7號(hào)染色體上，含有一個(gè)1071 bp的ORF框，編碼356個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為39 kDa，等電點(diǎn)pI為5.92。將其ORF推導(dǎo)的

4、氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比對(duì)，其結(jié)果顯示：GhGS1與水稻、大豆、擬南芥、玉米等植物的GS1同源性較高。擬南芥中的GS基因家族被分為2類（GS1、GS2），從陸地棉基因組檢索出14個(gè)與擬南芥GS同源的基因。進(jìn)一步進(jìn)化樹分析顯示：克隆的陸地棉GhGS1基因與擬南芥AtGS1基因分在同一個(gè)亞家族，且與AtGLN1;1基因親緣關(guān)系最近。
　　2．GhGS1基因的表達(dá)特性分析
　　采用Real-Time quantitive

5、PCR技術(shù)來探究GhGS1基因在棉花生長過程中的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，GhGS1基因在根中表達(dá)量最高，雄蕊表達(dá)量較高，葉片表達(dá)量最低。
　　用不同供氮水平營養(yǎng)液處理棉花幼苗，結(jié)果顯示：當(dāng)棉花幼苗生長于適氮水平（5 mM）時(shí)，GhGS1基因在棉花的側(cè)根表達(dá)量最高，其次是在主根。當(dāng)棉花幼苗生長于0.5 mM和1 mM兩種低氮水平時(shí)，無論地上部分（子葉、下胚軸），還是地下部分（側(cè)根和主根），其GhGS1基因的表達(dá)量明顯高于適氮水平，說明低

6、濃度氮能誘導(dǎo)GhGS1基因的表達(dá)，并且在子葉中的這種誘導(dǎo)作用更明顯。
　　3．GhGS1基因啟動(dòng)子序列的克隆與表達(dá)特性分析
　　通過設(shè)計(jì)特異性引物，以棉花基因組DNA為模板，克隆獲得了1965 bp的GhGS1基因啟動(dòng)子序列（PGhGS1）。Plantcare順式作用元件數(shù)據(jù)庫分析PGhGS1序列，發(fā)現(xiàn)在該調(diào)控序列中含有豐富的核心序列，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TATA-box）和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子（CAAT-box）。同時(shí)也含有豐富的光反應(yīng)、

7、激素反應(yīng)及脅迫反應(yīng)元件，表明GhGS1基因的表達(dá)會(huì)受到多種因素的影響。
　　將 GUS基因與 GhGS1啟動(dòng)子序列融合，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-PGhGS1::GUS，并分別轉(zhuǎn)入棉花及擬南芥，對(duì)獲得的 T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，GhGS1基因啟動(dòng)子在棉花的各個(gè)部位均有染色，在根、雄蕊、莖的染色較深，表達(dá)較強(qiáng)。染色結(jié)果與Real-Time PCR檢測(cè)的GhGS1基因在棉花中的表達(dá)特性大致吻合。GhGS1

8、基因啟動(dòng)子在擬南芥除成熟葉片外的其他各個(gè)部位均能檢測(cè)到GUS信號(hào)，其在根、莖、雄蕊、雌蕊的表達(dá)信號(hào)較強(qiáng)。該基因啟動(dòng)子在擬南芥和棉花中的表達(dá)模式基本一致。
　　4．超量表達(dá)GhGS1基因可在一定程度上提高棉花對(duì)低氮脅迫的適應(yīng)能力。
　　為了進(jìn)一步研究低氮條件下GhGS1基因在棉花中對(duì)氮素的利用情況，構(gòu)建了CaMV35S組成型啟動(dòng)子控制的GhGS1超量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化棉花，經(jīng)篩選獲得了超量表達(dá) GhGS1轉(zhuǎn)基因棉花植株。在正常施

9、肥水平營養(yǎng)缽中生長的超量表達(dá)GhGS1棉花 T1代植株與野生型棉花均生長良好，葉綠素含量差異不顯著。分別對(duì)野生型棉花、超量表達(dá)GhGS1轉(zhuǎn)基因棉花T2植株進(jìn)行低氮脅迫處理發(fā)現(xiàn)，經(jīng)適氮水平水培（氮濃度為5 mM），超量表達(dá)GhGS1棉花植株與野生型棉花葉片都呈深綠色，生長狀態(tài)良好，葉綠素含量無明顯差異，而在低氮水平（氮濃度為0.1 mM）生長條件下，野生型棉花葉片發(fā)黃，老葉尤為明顯，而超量表達(dá)GhGS1棉花植株的葉片仍生長良好。葉綠素含量