hla-a2＋供者外周血hcmv特異性ctl的定量及其表型分析

1、I S S Nl 0 0 7—8 7 3 8· 論著 -C h i nJC e l lMo lI m m u n o 1 ) 2 0絲 (2 4 7文章編 號(hào) ：1 0 0 7— 8 7 3 8 ( 2 0 0 6 ) 0 2— 0 2 4 7— 0 5H L A ． A 2 + 供 者 外周 血 h C MV特 異性 C T L的定 量及 其 表 型分 析 查慶兵 ， 何 賢輝 ，徐 麗慧 一，遲 曉云 ，曾耀 英 (

2、 暨南 大學(xué) ：組織移植與免疫 中心教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，生物工程研究所 ， 廣東 廣州 5 1 o 6 3 2 )Qu a n t i f i c a t i o na n dp h e n o t y p i ca n a l y s i so fh CM V s p e c i f icCTL i np e r i p h e r a lb l o o df r o m H LA． A2do n o r sZ H AQn g —

3、 b i n g，嬲 X i a n — h u i，X UL i - h u i一，C H IXi a o ． y u n， ZE NGY a o — y i n gK e yL a b o r a t o r yo fMi n i s t r y o fE d u c a t i o nf o rTi s s u eT r a n s p l a n t a -t i o na n dI mmu n o l o g y ；I n

4、s t i t u t eo fB i o e n g i n e e r i n g ， J i n a nUn i v e r s i -t y，Gu a n g z h o u51 0 6 3 2，C h i n a[ A b s t r a c t ]A I M： T oo p t i m i z et e t r a m e rs t a i n i n gc o n d i t i o nu s i n gH L A - A

5、 {0 2 0 1t e t r a me r ( A 2 - N L Vt e t r a me r ) l o a d e dw i t hN L Vp e p t i d e( p p 6 5 4 9 5 - 5 0 3 )d e n v e df r o ms t r u c t u r a lp r o-t e i np p 6 5o fh u ma nc y t ome g a l o v i r u sa n dt oi

6、n v e s t i g a t ei t sa p p l i c a t i o ni np h e n o t yp i n go fs p e c i f i cc y t o t o x i cTl y mp h o -c y t e s( C T L ) ．M E T HOD S： P e r i p h e r a lb l o o df r o m H L A - A 2d o n o m wa sf i r s

7、ts t a i n e dwi t hA2 - NL Vt e t r a me r ／ PEu n d erd ． f -f e r e n tc o n d i t i o n sa n dt h e nI a b el e dwi t ha n t i ． CD3 ． F I T C a n da n t i - CD8 - APC． Th es t a i n e ds a mp l e swe r ea n a l y z

8、 e dwi t hf l o w c y t o me t r yt of i n do u tt h eo p t i mi z e ds t a i n i n gc o n d i t i on ．Me a n wh i l e ， t h ep h e n o t yp ea n da c t i v a t i o na n t i g e ne x p r es s i o nwe r ed e t er mi n e

9、d ． RES ULT S：Te t r a mers t a i n i n gwi t hwh o l eb l o o dwa ss u p e n o rt op e r i p h e r e lb l o o dmo n o n u cJ e a rc e l l s ．Th eo p t i mi z e dc o n d ~ i o nf o rt e t r a me rs t a i n i n gwa si n c

10、 u b a t i n g1 0 0I J Lo fwh o l eb l o o dwi t h0． 3l a go fA 2 - NL V t e t r a mer f or1ha t4 ℃ ．U n d e rt h i sc o n d i t i o nt h es p e c i f i cs t a i n i n gwa ss t r on gwh i l eu n s p e c i f i cs t a i n

11、 i n go fCD8一 T c e l l swa sq u i t ewe a k ．Ph e n o t yp i ca n a l y s i su n d e rt h i sc o n d i t i o ns h o we dt h a tt h er a -t i Oo fCD2 8p o s i t i v eA 2 - NL Vt e t r a mers p e c i f i cCTLwa sl o we r

12、t h a nt h a to fn o n s p e c i f i cCTL，wh e r e a st h er a t i oo fCD5 7p o s i t i v es p e c i f i cCTLwa sh i g h ert h a nt h a to fn on s p e c i f i cCT L．CD2 5mo l e c u l e swe r eo n l ye x p r es s e dont h

13、 ea c t i v a t e d收稿 日 期 ： 2 0 0 5 — 0 6— 2 0 ： 修 回日期 ： 2 0 0 5 — 0 9— 0 5基金項(xiàng)目：國(guó)家 自 然科 學(xué)基 金重點(diǎn)項(xiàng) 目資助 ( N o ． 3 0 2 3 0 3 5 0 ) ；國(guó)家 自然科學(xué)基金面上項(xiàng) 目資助 ( N o ． 3 0 3 7 1 6 5 1 ) ；國(guó) 家重 點(diǎn)基礎(chǔ) 研 究發(fā)展規(guī)劃( 9 7 3 ) 項(xiàng) 目資助( N o ． G 2 0 0 0

14、5 7 0 0 6)作者簡(jiǎn)介： 查慶兵( 1 9 7 5一 ) ，男， 安徽安慶人 ， 碩士生．C o r r e s p o n d i n ga u t h o r ， T e l ：( 0 2 0 ) 8 5 2 2 0 6 7 9E ma i l ：t h e x h @j a M ． e d u ． c as p e c i f i cCTL ． CONCLUS I ON ：Th eo p t i mi z e dt e t

15、r amers t a i -n i n gc o n d i U onc a ni n c r e a s et h es p e c i f i c i t yo ft e t r a me rs t a i 。n i n ga n dd e c r e a s eu n s p e c i f i cb i n d i n g， t h e r e f o r ei ti sa p p l i c a 。b l ef o rp h

16、 e n o t yp i n ga n df u n c ti o n a la n a l y s i so fa n t i g e n - s p e c i f -i cCTL [ Ke y w o r d s ] H L A - A 2t e t r a me r ；c y t o m e g a l o v i r u s ；C T L ；t e t r a me rs t a i n i n g[ 摘 要 ]目的 ： 利

17、用 加 載人 巨細(xì) 胞 病毒 ( h C M V ) 結(jié) 構(gòu) 蛋 白p p 6 5衍生抗原 肽 N L V( p p 6 5) 的 H L A - A{ 0 2 0 1 ( A 2 - N L V)四聚體 ， 探討 四聚體染色條件 的優(yōu)化及其 在特異性 C T L表型 分析中的應(yīng) 用。方 法 ： 取 HL A - A 2供 者 外周 血 ，以 A 2 - N L V四聚體／ P E在不同條件 下染色 ， 然 后 以 a n t i -

18、C D 3 - F I T C和 a n t i -C D 8 - A P C標(biāo)記 ，流式 細(xì)胞 術(shù)分析 染色結(jié) 果 ，尋找 四聚體最 佳 染色條件 ， 并分 析特 異 性 C T L的表 型 和活 化抗 原 表達(dá) 。結(jié) 果 ： 以全血樣 進(jìn) 行 四聚 體 染色 結(jié) 果 優(yōu) 于分 離 的 P B M C 。A 2 -N L V四聚體用量為 0 ． 3I x g 時(shí) ， 與 1 0 0I x L全血于 4 ℃溫育 lh ，特異性染色效果最

19、佳 ， 而與 C D 8 一 T細(xì)胞非特異 性結(jié)合很 低。以此優(yōu)化條件進(jìn)行特 異性 C T L 表 型分析 ， 結(jié) 果顯 示 C D 2 8陽(yáng)性的 A 2 一 N L V四聚體 特 異性 C T L的百 分 率 較 非特 異性 C T L低 ， 表達(dá) C D 5 7的百分率較非特 異性 C T L高 ，C D 2 5分 子只表 達(dá)于活化的特異性 C T L上。結(jié)論 ： 通 過(guò)對(duì)染 色條件進(jìn) 行優(yōu)化 可明顯提高 四聚體染色 的特 異性 ，

20、 降低 非特 異性結(jié) 合 ， 優(yōu)化 的四聚體染色法能用 于抗原特異性 C T L的表型 和功能分析 。[ 關(guān)鍵詞 ] H L A — A 2四聚體 ； 巨細(xì)胞病毒 ； C T L ； 四聚體 染色 [ 中圖分 類號(hào)]R 3 9 2 ． 1 2[ 文獻(xiàn)標(biāo) 識(shí)碼 ]A細(xì)胞 毒 T淋 巴細(xì) 胞 ( c y t o t o x i cTl y m p h o c y t e s ，C T L ) 在機(jī)體抗感染和抗腫瘤免疫 、 移植排斥反應(yīng) 以及

21、某些 自身免疫疾病等過(guò)程 中發(fā)揮關(guān)鍵作用¨J 。分 析 抗原 特異 性 C T L的數(shù) 量 和 功能 ，對(duì) 于深 入 研 究 特 異性 細(xì) 胞免 疫 應(yīng) 答具 有 重 要 意 義 。利 用 主 要 組 織 相 容性復(fù)合體 ( M H C ) I 類分子 四聚體( M H CIt e t r a m e r )染色對(duì)抗原特異性 C T L進(jìn)行定量 分析， 是 近年來(lái)發(fā) 展成熟的細(xì)胞免疫學(xué)核心技術(shù)之一 ， 不僅可 以分析 特異性

22、C T L的數(shù)量 ， 而且能夠測(cè)定特異性 C T L的表 型和功能 。人巨細(xì)胞病毒 ( h u m a nc y t o m e g a l o v i r u s ，h C M V ) 在人群中的感染率極高 ， 器官和干細(xì)胞移植 維普資訊 http://www.cqvip.com I S S N 1 0 0 7 — 8 7 3 8 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志( — C h i nJ — C e l lM o lI m m u n o 1 )

23、 2 0 0 6 , 2 2 ( 2擇 全血進(jìn)行 四聚體染 色。作 為陰性 對(duì)照 ，以相應(yīng)量 的 S t r e p t a —v i d i n — P E對(duì)同一全血樣品染 色 ，或 以 A 2 一 N L V四聚體 對(duì) H L A —A 2 一 、 h C M V血清 陽(yáng)性供者 的全血染色 ， 結(jié)果均在 0 ． O 1 ％或 以下( 圖 2 ) ， 提示 了 A 2 一 N L V四聚體具有高度特異性 。CD8 ／ AP CC D

24、8 ／ A 圖 1H L A — A 2 ’ 供者 P B M C和全血 的 A 2 一 N L V四聚體染色 比 較 F i g1C o m p a r i s o no fA 2 一 N L Vt e t r a m e rs t a i n i n go fP B MC ( A)a n dw h o l eb l o o d( B )f r o mHL A — A 2d o n o rT h ed a t ar e p r e s

25、 e n tt h ep e r c e n t a g e so fA2 一 NL V t e t r a me rp o s i t i v eC TLi nt o t a lTc e l l s ．圖 2A 2 一 N L V四聚體染色 對(duì)照組的檢測(cè) F i g2C o n t r o lg r o u p sf o rA 2 一 NL Vt e t r a me rs t a i n i n gA：S t r e p t a

26、v i d i n ／ P E s t a i ni n go fw h o l eb l o o df r o m o n eHL A— A2d o n o r ；B：A 2一 NL Vt e t r a me rs t a i n i n go fwh o l eb l o o df r o m o n eHL A— A2一 a n dh CMVs e r o p o s i t i v ed o n o r ．2 ． 3A

27、2 · N L V四聚體 最佳 用量 的選擇 參考以往報(bào)道 』 ， 初 步選擇在 4 ℃溫 育 1h 條件下 ， 比較不 同用量 的 A 2 一 N L V四聚體染色結(jié)果 ，以確定 四聚體 最佳 用量 。結(jié) 果顯示 ，當(dāng)四聚 體 用量不斷下降 時(shí)，A 2 一 N L V特 異性 C T L的染 色熒 光強(qiáng)度 逐 漸 下降 ， 同時(shí) C D 8 一 T細(xì)胞 的非 特異性 染 色也 逐漸 減少 ， 但 是 A 2 一 N L V

28、特異性 C T L陽(yáng)性率基本 保持 不變或略 微上升 而后 又 下降( 圖 3 ) 。當(dāng)每 1 0 0L全血 A 2 一 N L V四聚體用量為 0 ． 3I - t g時(shí)， 特異性 C T L 染 色結(jié) 果最佳 ， 即染色 的 C T L 熒 光強(qiáng)度保 持 較高 水平 而非特異性染 色明顯減少 ( 圖 3 C ) ， 因此 ， 以后選擇 此用量進(jìn) 行染 色。2 ． 4A 2 - N L V 四聚體染色溫度和時(shí) 間的 比較 在 A 2

29、一 N L V 四 聚體用 量 為 0 ． 3I - t g 、時(shí) 問(wèn) 為 lh條 件 下 ，比較 4 ~ C、 2 5 ~ C、3 7 ~ C的染 色 結(jié) 果，表 明 四聚 體 染色 陽(yáng)性 的 A 2 一 N L V特 異 性 C T L百 分率 相似 ， 但 4 ~ C和 2 5 ~ C條件 下 非特 異 性 明 顯低 于 3 7 ~ C( 圖 4 ) ，為了便 于控 制條 件 ，選擇 4 ~ C為染 色溫 度。 同時(shí) ， 在溫度

30、為 4 ~ C、四 聚體 用 量 相 同 條件 下 ，比較 3 0mi n 、1h 、 2h3種 不同染 色時(shí) 問(wèn) ，結(jié)果 發(fā)現(xiàn) 1h染 色時(shí) 間 已足夠 ( 圖 5 ) ，因此 ， 選擇溫育 1h為進(jìn)一 步的染色條件 ?？?。 一^ 0 —0 B 2 4 9圖 3全血( 1 0 0L ) 樣品 A 2 一 N L V四聚體最佳用量的選擇 F i g3T i t r a t i o no fA2 一 N L Vt e t r a

31、 me rd o s a g ef or1 0 0I ． L Lw h o l eb l o o df r o m o n eHL A— A 2d o n o rT h ed o t t e dl i n e si n d i c a t et h er el a t i v ef l u o r e s c e n c ed e n s i t yo ft e t r a me rp o s i —t i r eC TL．Th ed

32、 a t ar e p r es e n tt h ep e r ce n t a g e so fA 2一 NL Vt e t r a me rp o s i t i v eCT Li nt o t a lTc e l l s ．A ： 3I - t go fA 2一 NL Vt e t r a me r ；B：II - t g；C： 0． 3I - t g；D：0． II - t g；E：0 ． 0 3I ． r g ；F：0． O

33、II - t g ．暑一 一弓 l c一007 ％ 03 5％ _量 l 01 0 1l 01 0 4CD8 ／ AP C0 0 6 ％ 03 I ％ ●疊 02 7 ％ 03 5 ％ 圖 4 溫度對(duì) A 2 一 N L V四聚體染色的影響 F i g4T h ee f f e c to ft e mp e r a t u r eo nA 2一 N L Vt e t r a me rs t a i n i n gTh ed

34、a t ao nt h eu p — r i g h tq u a d r a n tr e p r e s e n tt h ep e r c e n t a g e so fA2 一 NL V t e t —r a me rp o s i t i v eCT Ii nt o t a lTc e l l sw h i l et h en u mb e r so nt h eu p — l e f tq u a d —r a n ti

35、 st h eu n s p e c i f i cs t a i n i n g 。A：4℃ ；B：2 5℃ ：C：3 7℃ gb一 一三Z 一 03 2％ I I l l0 ” 1 01 01 0 ， l 0 4CD8 ， AP C 037 ％ ● 圖 5溫育時(shí)間對(duì) A 2 一 N L V四聚體染 色結(jié) 果的影響 F i g5Th ee f f e c to fi n c u b a t i o nt i meO nA 2 一

36、NL Vt e t r a me rs t a i n i n gT h ed a t ar e p r e s e n tt h ep e r ce n t a g e so fA 2一 NL Vt e t r a me rp o s i t i v eC TLi nt o t a lTc e l l s ． A：3 0mi n；B：1h；C：2h ．一_ 0 ll0 l： 。 一山 d ／ ?；?工 1、z《維普資訊 http:/