異體反應(yīng)性NK細(xì)胞誘導(dǎo)供者特異性耐受的作用機(jī)理初探.pdf

1、目的：探討異體反應(yīng)性NK細(xì)胞在非清髓骨髓移植中誘導(dǎo)供者特異性耐受的作用機(jī)理。 方法：以近交系C57BL/6J(H-2Db)雌鼠為受鼠，C57BL/6J×BALB/c雜交F1代(H-2Db/d)雌鼠為供鼠，以氟達(dá)拉濱與環(huán)磷酰胺為移植前的非清髓化療方案，進(jìn)行H-2單倍體骨髓移植。應(yīng)用高強(qiáng)度磁珠分選系統(tǒng)純化供鼠NK細(xì)胞亞群。分選前后NK細(xì)胞的純度用流式細(xì)胞儀檢測(cè)；采用LDH釋放法檢測(cè)磁珠分選后的NK細(xì)胞對(duì)Yac-1淋巴瘤細(xì)胞、自體及異

2、體淋巴細(xì)胞的殺傷。按照對(duì)C57小鼠預(yù)處理?xiàng)l件的不同分為兩組：A組先行化療預(yù)處理，再行骨髓移植；B組行化療預(yù)處理后，輸注供鼠NK細(xì)胞的同時(shí)行骨髓移植。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)移植后90天內(nèi)A、B兩組小鼠脾臟和骨髓中H-2Dd細(xì)胞比例，檢測(cè)供體嵌合情況：以F1代小鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，移植后7天、14天、21天、28天的兩組小鼠及正常C57小鼠的脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)；以F1代小鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，以正常C57小鼠的脾細(xì)胞作為效

3、應(yīng)細(xì)胞，并分別加入移植后23天A組和B組的不同濃度CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD4+CD25+細(xì)胞與CD4+CD25+細(xì)胞行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)；用流式細(xì)胞法比較移植后14天、23天A組和B組脾臟的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化；用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)移植后23天A組和B組脾臟、胸腺CD4+CD25+和CD4+CD25中IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β、IFN-γ、FoxP3的mRNA水平；應(yīng)用ELISA法檢測(cè)在供受者混合淋巴

4、細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入A組與B組不同劑量的CD4+細(xì)胞、CD4+CD25+細(xì)胞后，其上清中IFN-γ的分泌量：采用A組和B組移植后14天的胸腺分選的CD11c+細(xì)胞與正常C57小鼠的脾細(xì)胞分選的CD3+細(xì)胞體外共孵育培養(yǎng)5天，采用流式細(xì)胞法比較兩組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化并應(yīng)用ELISA法檢測(cè)其對(duì)供者特異性IFN-γ分泌情況的影響。 結(jié)果：分選前脾臟單個(gè)核細(xì)胞中NK細(xì)胞的比例為(19.85±4.27)％，分選后NK細(xì)胞的比例為(74.63

5、±5.5)％；NK細(xì)胞亞型對(duì)Yac-1細(xì)胞的殺傷活性為(65.52±8.76)％；F1代小鼠純化NK細(xì)胞亞型對(duì)異體C57小鼠淋巴細(xì)胞的殺傷活性為(60.18±1.03)％；而受體的NK細(xì)胞對(duì)自體的淋巴細(xì)胞無殺傷活性，說明異體反應(yīng)性NK細(xì)胞具有殺傷活性。B組與A組比較，H-2Dd細(xì)胞比例明顯增高，移植后28天A組小鼠脾臟嵌合率為(7.50±0.70)％，骨髓中供體細(xì)胞嵌合率為(10.20±2.40)％，B組小鼠脾臟嵌合率為(46.20±5

6、.00)％，骨髓嵌合率為(28.7±5.9)％，兩組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01，兩組在60天時(shí)仍有差別，在90天時(shí)B組脾臟H-2Dd細(xì)胞比仍高于A組，而骨髓中的嵌合率無明顯差異；混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，與正常C57小鼠相比，A、B兩組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖比例降低，而B組小鼠增殖比例的降低程度比A組要高，移植后28天正常C57小鼠的刺激指數(shù)是(1.48±0.23)，A組是(1.14±0.13)，B組是(0.91±0.05)，組間比

7、較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；在以F1代小鼠淋巴細(xì)胞與正常C57小鼠的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中加入移植后23天兩組不同濃度的的CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD4+CD25+細(xì)胞與CD4+CD25-細(xì)胞，結(jié)果表明其中起增殖抑制作用的細(xì)胞是CD4+細(xì)胞而不是CD8+細(xì)胞，并且是CD4+CD25+細(xì)胞而不是CD4+CD25-細(xì)胞。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果示在移植后23天B組脾臟出現(xiàn)CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞，而A組則無。實(shí)時(shí)熒

8、光定量RT-PCR法結(jié)果顯示：A組脾臟和胸腺的IFN-γ的含量均比B組高，而B組的FoxP3比A組高，兩兩比較較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；此外在脾臟A組的IL-2較B組高，而在胸腺則表現(xiàn)為A組的IL-4較B組高，兩組之間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。體外誘導(dǎo)的結(jié)果顯示來自B組胸腺的CD11c+細(xì)胞可誘導(dǎo)C57小鼠產(chǎn)生CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞，并且在F1與C57小鼠淋巴細(xì)胞共孵育時(shí)加入該Treg細(xì)胞，可使其IFN-