EIAV誘導的特異性T細胞免疫應答檢測方法的建立.pdf

1、馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)是一種雙鏈RNA病毒，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)慢病毒亞科(Lentivirus)，是嚴重危害養(yǎng)馬業(yè)的馬傳染性貧血(EIA)病原體。馬傳染性貧血病毒(EIAV)主要侵害宿主的免疫系統(tǒng)。馬傳貧病毒在急性發(fā)病期主要在組織中分化的巨噬細胞中復制，病毒可以進入存在于外周血未分化的單核細胞，但不能在單核細胞內(nèi)復制形成成熟的病毒粒子。馬傳染性

2、貧血病毒進入機體后，首先受到固有免疫系統(tǒng)的攻擊，包括生理屏障和非特異性免疫細胞及其分泌的各種免疫分子。然后是特異性免疫系統(tǒng)的攻擊，包括體液免疫和細胞免疫，由于其主要是通過細胞與細胞間的接觸進行擴散，接觸不到體液，所以細胞免疫在抗馬傳染性貧血病毒中起主要作用。主要通過CD8+T細胞接受內(nèi)源性抗原刺激后分化增殖為細胞毒性T細胞發(fā)揮免疫作用。機體細胞免疫的檢測對于某些疾病的診斷和發(fā)病機理研究、免疫治療或預防接種的效果評估及環(huán)境因素對機體免疫功

3、能的影響，都具有重要的意義。我國自主研制的EIAV弱毒疫苗是目前世界上唯一能夠克服抗原變異而產(chǎn)生有效保護的慢病毒疫苗，也是迄今為止唯一廣泛應用的慢病毒疫苗。通過對已成功的慢病毒疫苗免疫應答本質(zhì)的探索，可以為HIV等其他慢病毒疫苗的研究提供借鑒。但由于相應檢測方法的缺乏，限制了對于EIAV弱毒疫苗的免疫保護機制的全面認知。特別是，在近幾年的研究中，本實驗室利用建立的相關方法對弱毒疫苗和強度疫苗免疫誘導的免疫應答的特點的對比性分析，顯示出細

4、胞免疫應答對EIAV弱毒疫苗免疫保護中具有重要作用。因此，建立相關的免疫檢測方法具有重要意義。
　　 本項研究擬建立馬屬動物ELISPOT的檢測方法，使之能夠用于EIAV感染后IFN-γ表達情況的研究。同時，應用建立的方法對EIAVp26蛋白的有效表位進行初步探討，旨在找到能夠誘導免疫保護的保守性表位。為EIAV的免疫保護機制的研究以及新型疫苗的構建提供重要的科學依據(jù)。
　　 首先，從14試驗馬的外周血單個核細胞PBMC

5、(Peripheral blood mononuclear cells)提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增后進行T-A克隆。每匹馬隨機挑取約10～20個陽性克隆用于序列比對及等位基因多態(tài)性的量化分析。結(jié)果顯示，14匹試驗馬各自具有2～4個等位基因，為正在開展的針對EIAV減毒疫苗核心蛋白(p26)的CTL表位的篩選提供基礎性數(shù)據(jù)。其次，建立了一種操作簡單、靈敏度高、準確性好、可以對單個細胞進行檢測的細胞免疫ELISPOT檢測方法，可以對馬