大量擴(kuò)增抗原特異性活化T細(xì)胞的方法研究.pdf

1、癌癥的高發(fā)率和年輕化的趨勢已經(jīng)越來越威脅到人類的健康。目前，已有的治療方法包括:外科手術(shù)切除法，放療，化療等等。但是目前這些方法都不能完全治愈癌癥，然而，過繼性免疫細(xì)胞治療為癌癥的治療帶來了新的希望。與傳統(tǒng)的腫瘤治療方法不同，大多數(shù)免疫治療在消除腫瘤的過程中顯示出重要的作用，而且可以通過誘導(dǎo)免疫記憶來建立腫瘤與機(jī)體之間新的平衡，從根本上治愈腫瘤。免疫細(xì)胞治療技術(shù)與其他抗腫瘤策略如手術(shù)、放化療的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)證實優(yōu)于單一的治療方案，極大拓寬

2、了細(xì)胞免疫治療。
　　過繼性免疫細(xì)胞治療是指通過輸入自身或同種異體的腫瘤殺傷細(xì)胞來治療腫瘤的方法。它不僅可以糾正細(xì)胞免疫功能的低下，促進(jìn)宿主抗腫瘤免疫的功能，還可以直接發(fā)揮抗腫瘤的作用。其中細(xì)胞毒性T細(xì)胞的過繼治療有著特殊的優(yōu)越性。細(xì)胞毒性T細(xì)胞的過繼治療是實體腫瘤，尤其是腫瘤相關(guān)抗原比較明確的惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等的研究熱點。特異性CTLs（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）的產(chǎn)生是通過將腫瘤抗原負(fù)載成熟的DC（樹突狀細(xì)胞

3、）刺激T細(xì)胞從而獲得單一抗原的特異性CTLs克隆。這種CTL能識別并殺傷攜帶相應(yīng)腫瘤抗原的惡性細(xì)胞，經(jīng)過大量的擴(kuò)增就能應(yīng)用于臨床治療。這種治療方法相比其他的治療方法具有易獲得、可操作性強(qiáng)，靶向性好，安全性高等特點。
　　但是，過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移還面臨很多的問題:DC的成熟程度低，免疫耐受，特異性活化T細(xì)胞的數(shù)量不足等等。由于DC擴(kuò)增具有很大的難度，所以這也間接限制了特異性活化T細(xì)胞的數(shù)量。本文主要通過以下三個步驟建立擴(kuò)增抗原特異性T

4、細(xì)胞的方法:
　　(1)用Ficoll密度梯度離心的方法從癌癥病人外周血中分離單核細(xì)胞后貼壁培養(yǎng)并將懸浮的T淋巴細(xì)胞凍存以備后續(xù)試驗之用。培養(yǎng)單核細(xì)胞時加入細(xì)胞因子FLT3L，GM-CSF，IL-4誘導(dǎo)分化，在培養(yǎng)第6天以MOI值為5加入Ad5-MUP53負(fù)載抗原。最后加入細(xì)胞因子TNF-α，LPS，PGE-2誘導(dǎo)DC成熟。
　　(2)將培養(yǎng)成熟的DC與相同人的初始T細(xì)胞以1∶10的比例共培養(yǎng)。在之后的培養(yǎng)中連續(xù)加入DC刺激

5、T細(xì)胞形成抗原特異性的活化T細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞過程中每兩天加入IL-2，IL-7，IL-15促進(jìn)細(xì)胞的生長。
　　(3)將共培養(yǎng)后的T細(xì)胞轉(zhuǎn)入包被了CD3，CD28抗體的小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并進(jìn)行大量擴(kuò)增。培養(yǎng)細(xì)胞過程中每兩天加入IL-2，IL-7，IL-15促進(jìn)細(xì)胞的生長。
　　本文通過以上三個步驟建立了能大量擴(kuò)增抗原特異性活化T細(xì)胞的方法，最多能將細(xì)胞擴(kuò)增至30倍左右。具體結(jié)果如下:
　　(1)我們發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的細(xì)胞中CD3

6、，CD8的陽性比例較高，說明培養(yǎng)出的細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞的比例很高，而且CD8+的特異性活化T細(xì)胞的占有很高的比例。
　　(2)流式檢測還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞中CD4+CD25-的細(xì)胞比例很低，這說明Treg細(xì)胞的比例很低。Treg細(xì)胞是一種維持體內(nèi)免疫平衡，與免疫耐受機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞。所以較低的Treg細(xì)胞比例有利于培養(yǎng)的細(xì)胞行使免疫殺傷的功能，并且能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
　　(3)通過本文方法培養(yǎng)的細(xì)胞中能分泌大量的IFN-γ的細(xì)胞占較