磁性人工抗原提呈細胞微孔反應(yīng)板的研制及HBV抗原特異性T細胞數(shù)量與功能的檢測.pdf

1、當(dāng)今醫(yī)學(xué)檢驗試劑領(lǐng)域，病原體特異性基因、抗原和抗體的檢測試劑盒很多，競爭性也很強，但是卻沒有廠家生產(chǎn)針對病原體特異性T細胞的檢測試劑盒。
　　抗原特異性T細胞(Antigen-specific T cell，AST)是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細胞，在清除與控制病原體感染、監(jiān)視和殺傷腫瘤細胞及自身免疫性疾病的免疫損傷中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。眾所周知，在抗病毒感染和抗腫瘤中，細胞免疫比體液免疫更加重要，即T細胞的作用比B細胞產(chǎn)生的抗體

2、更重要?？乖禺愋訲細胞數(shù)量的多少和功能的強弱直接反映了人體特異性細胞免疫的功能狀態(tài)，在監(jiān)測疾病進程、指導(dǎo)治療方案、評價臨床療效、預(yù)測疾病慢性轉(zhuǎn)歸以及疫苗效果評估等方面都有著不同于抗體的重要參考價值。盡管抗原特異性T細胞的檢測技術(shù)從最初的51Cr釋放法、有限稀釋法、細胞內(nèi)細胞因子染色法到現(xiàn)在的ELISPOT法、pMHC多聚體流式分析法、蛋白芯片法等已經(jīng)有了快速發(fā)展。盡管這些技術(shù)方法各有優(yōu)點，但是各自的缺點也非常明顯。目前臨床上依然極少對

3、患者進行抗原特異性T細胞數(shù)量和功能的監(jiān)測。因此，進一步探索操作簡便、無需特殊儀器、無需HLA基因分型、能同步檢測抗原特異性T細胞數(shù)量和功能的新方法和新試劑非常重要和急迫，為精準醫(yī)療提供重要的診療手段。
　　研究目的:
　　將磁珠式人工抗原提呈細胞技術(shù)、ELISPOT技術(shù)、磁性細胞分選技術(shù)以及微孔反應(yīng)板有機整合一體，建立特異性細胞免疫功能狀態(tài)的檢測平臺:即磁珠式人工抗原提呈細胞微孔反應(yīng)板(aAPC-microplate)。首先

4、，自制H-2Kb/OVA257-264單鏈三聚體(SCT)，利用aAPC-microplate同步檢測OT-1轉(zhuǎn)基因鼠中OVA257-264抗原特異性CD8+T細胞的數(shù)量和功能，進行方法學(xué)評估;然后用同樣技術(shù)制備HLA-A2/HBV peptide多聚體，利用aAPC-microplate技術(shù)對慢性乙肝患者和健康體檢者的外周血中HBV特異性CD8+T細胞的數(shù)量與功能進行同步檢測，對該方法進行初步臨床驗證。
　　研究方法:
　

5、　1)利用重疊延伸PCR技術(shù)將OVA257-264、(GS4)3、β2m、(GS4)4和H-2Kb(α1/α2/α3)依次串聯(lián)為H-2Kb/O VA257-264單鏈三聚體基因(SCT)，聯(lián)合同源重組克隆技術(shù)將其插入pET28a原核表達載體，制備pMHC單體和四聚體，驗證其空間構(gòu)象和與TCR的結(jié)合能力;然后包被磁珠，制備成人工抗原提呈細胞微孔反應(yīng)板，同步檢測OT-1轉(zhuǎn)基因鼠中OVA257-264抗原表位特異性CD8+T細胞的頻率和反應(yīng)活

6、性，進行特異性、準確性、靈敏度、重復(fù)性或精密度等方法學(xué)指標的評估，并與進口商品化H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光流式檢測法進行配對t檢驗和Pearson相關(guān)性分析，同時與傳統(tǒng)ELISPOT法比較反應(yīng)活性的檢測;
　　2)用金標準的PCR-Sequencing-Based Typing技術(shù)對86例健康體檢人員血液樣本和118例江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病血液標本分別進行HLA-A和HLA-B等位基因分型;利用基因重組克隆技

7、術(shù)構(gòu)建和表達所有頻率大于1％的13種HLA-A等位基因重鏈重組質(zhì)粒和8種常見HBV抗原表位與β2m輕鏈的重組質(zhì)粒;利用6種在線表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫和軟件對HLA-A*01∶01、A*03∶01、A*30∶01、A*31∶01、A*32∶01、A*33∶03和A*6801等7種HLA-A等位基因分子限制性的HBV相關(guān)抗原表位肽進行預(yù)測;
　　3)利用重疊延伸PCR和同源重組克隆技術(shù)構(gòu)建和表達HLA-A*0201/HBc18-27、HLA-

8、A*0201/HBs183-191、HLA-A*0203/HBc18-27、HLA-A*0203/HBs183-191、HLA-A*0206/HBc18-27等五種HLA-A2/HBVpeptide的單體和四聚體，包被磁珠，制備成制備成人工抗原提呈細胞微孔反應(yīng)板;對臨床慢性乙肝患者、健康體檢者外周血中HBc18-27和HBs183-191抗原表位特異性CD8+T細胞的數(shù)量與功能進行同步檢測;并與進口商品HLA-A2-Ig二聚體的熒光流式

9、分析法和傳統(tǒng)ELISPOT法進行比較。
　　研究結(jié)果:
　　1)成功構(gòu)建和表達H-2Kb/OVA257-264SCT融合基因，制備成H-2Kb/OVA257-264SCT單體，包被磁珠后用H-2Kb構(gòu)象特異性熒光單抗染色和流式分析，證實能強烈結(jié)合，提示構(gòu)象正確;制備成熒光標記的H-2Kb/OVA257-264SCT四聚體，流式法檢測4只OT-1鼠脾淋巴細胞群中OVA257-264抗原表位特異性CD8+T細胞頻率。結(jié)果與進口商

10、品化H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體的流式檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，證實H-2Kb/OVA257-264SCT與TCR的結(jié)合能力;
　　2)7只OT-1鼠脾淋巴細胞群同時經(jīng)aAPC-microplate法和H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體流式染色法檢測OVA257-264表位特異性CD8+T細胞的頻率，結(jié)果經(jīng)配對t檢驗顯示p=0.2464，表明無統(tǒng)計學(xué)差異，Pearson回歸分析顯示，相關(guān)系數(shù)r=0.946，P

11、＜0.01，相關(guān)方程為:Y=0.936X+3.262，顯示兩種檢測方法的吻合度很高;用H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體流式染色法檢測aAPC-microplate孔內(nèi)剩余細胞中OVA257-264特異性CD8+T細胞的純度，三次實驗分別為92.35％、91.22％和92.10％，表明aAPC-microplate法的特異性達到90％以上;aAPC-microplate法檢測7只OT-1鼠時，分析內(nèi)CV值分別為6.44％、4.

12、01％、6.31％、9.08％、6.63％、4.24％和3.11％，對其中1只進行三次獨立重復(fù)檢測，結(jié)果分別為25.47％、25.59％和24.49％，平均分析內(nèi)CV值分別為3.11％、4.41％和10.62％，三次檢測結(jié)果的分析間CV值為2.40％，平均分析內(nèi)CV值均低于15％，表明該檢測方法有良好的重復(fù)性或精密度，符合中國2000版生物制品鑒定標準;靈敏度分析顯示，在5個不同稀釋頻率(10％，1％，0.1％，0.05％，0.01％)

13、的樣品檢測中aAPC-microplate法與H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體流式染色分析法的配對t檢驗無統(tǒng)計學(xué)差異，p=0.3973，Pearson分析的相關(guān)系數(shù)r=0.998，P＜0.01，相關(guān)性方程為:Y=0.943X+0.21，aAPC-microplate方法可檢測的頻率下限低至0.01％-0.05％，與傳統(tǒng)的MHC多聚體染色加流式分析法相似，該靈敏度能滿足臨床標本檢測的需要;
　　3)3只OT-1鼠脾淋巴細

14、胞經(jīng)aAPC-microplate檢測頻率后，分選后的OVA257-264特異性CD8+T細胞群經(jīng)ConA刺激后分泌IFN-γ的反應(yīng)活性比分別為43.83％、41.87％和48.99％;同時對3只OT-1鼠脾淋巴細胞用傳統(tǒng)ELISPOT方法進行檢測，在OVA257-264抗原肽刺激后脾淋巴細胞群中分泌IFN-γ的細胞比例經(jīng)直線回歸方程校正后分別為4.44％、4.01％和4.98％。由于原理和結(jié)果表現(xiàn)形式不同，兩種方法的活性檢測結(jié)果不能直

15、接比較;
　　4)在對人群血液標本進行HLA-A/B位點基因分型中，共獲得所有頻率大于1％的13種HLA-A等位基因型和32種HLA-B等位基因;成功構(gòu)建和表達13種HLA-A等位基因的重鏈重組質(zhì)粒和8種常見HBV抗原表位與β2m輕鏈的重組質(zhì)粒;利用在線表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測獲得HLA-A*01∶01、A*03∶01、A*30∶01、A*31∶01、A*32∶01、A*33∶03和A*6801等7種等位基因型限制性的HBV抗原表位肽序

16、列，每種等位基因均獲得多個高親和力的候選表位肽，分別來自HBsAg(P03138)、HBcAg(P03146)、HBpol(P03156)和HBx(P03165)等4種HBV抗原蛋白分子;
　　5)成功構(gòu)建和表達HLA-A*0201/HBc18-27、HLA-A*0201/HBs183-191、HLA-A*0203/HBc18-27、HLA-A*0203/HBs183-191、HLA-A*0206/HBc18-27等五種HLA-A

17、2/HBVpeptide的SCT分子，分別包被磁珠，制備成5種aAPC-beads，按照1∶1的比例混合，制備成HLA-A2限制性、HBc18-27和HBs183-191表位特異性的aAPC-microplate;
　　研究結(jié)論:
　　利用自制MHC多聚體建立的aAPC-microplate技術(shù)能對OVA257-264抗原特異性CD8+T細胞的數(shù)量和功能進行同步檢測，具有很好的準確性、特異性、靈敏度、重復(fù)性或精密度，可檢測的