檢測(cè)NDV誘導(dǎo)特異性IFN-γ、IL-4的ELISPOT試驗(yàn)方法建立及應(yīng)用.pdf

1、在病毒免疫過(guò)程中，不僅需要體液免疫，而且需要細(xì)胞免疫。如在新城疫的免疫方面，細(xì)胞免疫與體液免疫協(xié)同發(fā)揮作用。Ghumman(1976)等發(fā)現(xiàn)，接種新城疫活苗和滅活苗后2-3天，就能檢測(cè)到淋巴細(xì)胞內(nèi)DNA合成增加。Agrawal(1991)等用白細(xì)胞游走抑制試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)接種ND疫苗后細(xì)胞免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)接種后確實(shí)存在細(xì)胞免疫反應(yīng)。機(jī)體針對(duì)新城疫的細(xì)胞免疫和體液免疫之間究竟是怎么變化的呢?為什么經(jīng)常出現(xiàn)免疫失敗呢?這些問(wèn)題沒(méi)有明確的答案。

2、 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)(ELISPOT)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)的長(zhǎng)處，能夠分析經(jīng)特異抗原活化后分泌細(xì)胞因子(如IFN-γ、TNF-α等)的單個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的頻數(shù)，具有敏感、特異、易于重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)。本研究將ELISPOT技術(shù)應(yīng)用于新城疫細(xì)胞免疫的研究，通過(guò)對(duì)脾淋巴細(xì)胞濃度，培養(yǎng)時(shí)間，抗原刺激量進(jìn)行選擇，建立了檢測(cè)NDV誘導(dǎo)特異性IFN-γ、IL-4的ELISPOT方法。結(jié)果顯示，試驗(yàn)的特異性與培養(yǎng)時(shí)間和刺激抗原密切

3、相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)、刺激抗原越多，試驗(yàn)的特異性越低，當(dāng)抗原量為5ug/孔，培養(yǎng)時(shí)間為7h時(shí)，試驗(yàn)的特異性最強(qiáng)。ELISPOT斑點(diǎn)數(shù)，隨細(xì)胞濃度的增加而增加，當(dāng)小鼠的脾淋巴細(xì)胞濃度為106/孔時(shí)，最有利于斑點(diǎn)的計(jì)數(shù)，試驗(yàn)誤差最小。用建立的ELISPOT方法對(duì)NDV免疫小鼠的IFN-γ、Il-4水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、Il-4與血清抗體的產(chǎn)生存在著一定的時(shí)差關(guān)系，在血清抗體陽(yáng)性檢出的前期，IFN-γ的分泌降至最低水平，I