中國(guó)人群HIV-1B亞型特異性CTL應(yīng)答研究和HLA-A11類分子限制的CTL表位確定.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)絕大多數(shù)是由Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的全球流行的傳染病，并成為人類主要的致死性疾病之一。據(jù)2005年聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織的最新估計(jì)，自1981年首次發(fā)現(xiàn)HIV-1感染者以來(lái)，全球感染者累計(jì)7，000萬(wàn)人以上，現(xiàn)存人數(shù)4，030萬(wàn)，每年約新增感染者490萬(wàn)。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)雖能降低部分患者病毒含量，延緩病情發(fā)展，改善癥狀，但因費(fèi)用高、藥物副作用大使許多患者難以耐受

2、，也不能為大多數(shù)患者接受(特別是發(fā)展中國(guó)家患者)，更為重要的是HAART不能完全清除病毒。所以尋找有效HIV-1疫苗是目前迫切解決的問(wèn)題。大量研究證明細(xì)胞免疫特別是HIV-1特異性CTL應(yīng)答反應(yīng)在控制HIV-1感染中起關(guān)鍵作用。故研發(fā)以增強(qiáng)HIV-1特異性CTL效應(yīng)為目的的疫苗具有很大潛力。開(kāi)發(fā)此類疫苗首要的任務(wù)是確定能誘導(dǎo)強(qiáng)的HIV-1特異性CTL應(yīng)答并具有廣泛免疫原性的特異性表位。有效的HIV-1特異性CTL應(yīng)答不僅由抗原結(jié)構(gòu)決定，

3、同時(shí)受到HLA-Ⅰ等位基因限制，可見(jiàn)，篩選和鑒定具有強(qiáng)的和廣泛作用的HIV-1特異性CTL表位其中研究表位的HLA-Ⅰ類分子限制性是不可缺少的工作。不同人群HLA-Ⅰ等位基因的分布頻率不同，決定不同人群對(duì)HIV-1的CTL應(yīng)答模式不同，所以在不同人群開(kāi)展HIV-1特異性CTL應(yīng)答研究十分必要。中國(guó)作為世界人口最多的國(guó)家，存在許多潛在的HIV-1蔓延危險(xiǎn)因素，2003年底統(tǒng)計(jì)估計(jì)已有84萬(wàn)人感染HIV-1，開(kāi)發(fā)有效疫苗是阻止HIV-1感染

4、的最佳途徑。HLA-A*11等位基因型在中國(guó)人群中有較高的分布頻率，多次流行病學(xué)調(diào)查顯示在中國(guó)人群中分布頻率大于20％，而在白種人和黑人中分布頻率較低。對(duì)HLA-A11類分子限制的HIV-1特異性CTL表位的確定將對(duì)研發(fā)針對(duì)中國(guó)人群促使特異性CTL應(yīng)答的HIV-1疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 因HIV-1B亞型在中國(guó)存在廣泛流行，所以本研究選擇HIV-1B亞型感染者為研究對(duì)象，用ELISPOT法檢測(cè)覆蓋HIV-1B全基因序列肽庫(kù)誘導(dǎo)

5、的CTL應(yīng)答反應(yīng)，分析中國(guó)人群HIV-1B感染者HIV-1特異性CTL應(yīng)答特征，同時(shí)分析CTL應(yīng)答效應(yīng)與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及病毒載量的相關(guān)性，進(jìn)一步確定免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答區(qū)域。選擇兩位攜帶HLA-A*11等位基因型的HIV-1B感染者，將ELISPOT和細(xì)胞內(nèi)因子染色法相結(jié)合，根據(jù)培養(yǎng)的EB病毒轉(zhuǎn)染的B-LCL攜帶的HLA-Ⅰ基因型與CTL之間的匹配和不匹配關(guān)系確定表位的HLA-A11類分子的限制型。為篩選研發(fā)針對(duì)中國(guó)人群的HIV-1疫苗所需

6、表位奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1.選擇50例HIV-1B感染者為研究對(duì)象，用ELISPOT法檢測(cè)覆蓋HIV-1B全基因序列肽庫(kù)誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答反應(yīng)發(fā)現(xiàn)：應(yīng)答頻率較高和應(yīng)答效應(yīng)較強(qiáng)的多肽主要分布在Gag、Nef蛋白區(qū)，和文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)白種人群和非洲人群觀察的結(jié)果相似，但從每個(gè)蛋白區(qū)和單個(gè)肽段分析存在明顯差異。 2.CTL應(yīng)答效應(yīng)與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)(流式細(xì)胞儀測(cè)定)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：Gagp17/Gagp24/Gag

7、特異性CTL應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)度與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)存在明顯的正相關(guān)性，即CTL應(yīng)答反應(yīng)能力越強(qiáng)，患者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)水平越高。整體CTL應(yīng)答強(qiáng)度也與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)水平呈明顯的正相關(guān)性。CTL應(yīng)答效應(yīng)與血漿病毒載量(熒光定量RT-PCR測(cè)定)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：Gagp24/Gag特異性CTL應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)度與病毒載量呈負(fù)相關(guān)性，即CTL應(yīng)答能力越強(qiáng)，病毒載量越低。但整體分析HIV-1特異性CTL應(yīng)答強(qiáng)度與病毒載量沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

8、3.選擇兩例攜帶HLA-A*11基因型HIV-1B感染者為研究對(duì)象，將已確定可誘導(dǎo)CTL應(yīng)答效應(yīng)的陽(yáng)性肽段(15～20個(gè)氨基酸)進(jìn)一步切割，并通過(guò)濃度稀釋法再次用ELISPOT法測(cè)定CTL應(yīng)答反應(yīng)，最終確定35個(gè)HIV-1特異性CTL表位(8～11個(gè)氨基酸)。此項(xiàng)工作為進(jìn)一步確定HLA-A11類分子限制的HIV-1特異性CTL表位打下基礎(chǔ)。 4.根據(jù)兩例感染HIV-1B研究對(duì)象攜帶的HLA-Ⅰ等位基因型，EB病毒體外誘導(dǎo)B淋巴細(xì)

9、胞，建立永生化的B淋巴母細(xì)胞系(B-LCL)。本課題共建立5株HIV-1感染者和5株健康志愿者的B-LCL。 5.用細(xì)胞內(nèi)因子染色法檢測(cè)HIV-1特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)，通過(guò)PBMC中的效應(yīng)CTL細(xì)胞與靶細(xì)胞B-LCL攜帶的HLA-Ⅰ類分子之間匹配和不匹配關(guān)系確定誘導(dǎo)CTL應(yīng)答效應(yīng)的表位HLA-A11等位基因限制型。本實(shí)驗(yàn)共確定了6個(gè)HLA-A11限制的表位，其中IIATDIQTK為新發(fā)現(xiàn)表位，位于Int蛋白區(qū)(Pol918～93

10、4)，其它5個(gè)在既往研究中通過(guò)反相免疫法或鉻釋放法等傳統(tǒng)方法確定，分別是P1784-91(TLYCVHQR),Nef73-82(QVPLRPMTYK)，Nef84-92(AVDLSHFLK)，Int179-188(AVFIHNFKRK)，Env202-210(SVITQACPK)。選擇10例攜帶HLA-A*11基因型的HIV-1感染者觀察對(duì)確定的HLA-A11類分子限制表位應(yīng)答頻率，結(jié)果提示應(yīng)答頻率較低。 綜上所述，中國(guó)人群HI