腦出血患者外周血特異性microRNA表達(dá)特點(diǎn)的研究.pdf

1、研究目的：
　　腦出血(ICH)是具有高發(fā)病率和高死亡率的卒中類型，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。出血后腦水腫可以加重腦損傷是影響患者預(yù)后的主要因素。除行頭CT或MRI掃描外，目前尚缺乏無創(chuàng)而有效的監(jiān)測(cè)腦水腫變化的手段。近年，隨著循環(huán)中微小RNA(miRNAs)發(fā)現(xiàn)，越來越多的證據(jù)顯示其作為包括腦卒中在內(nèi)多種疾病的生物標(biāo)志物的有效性。miRNAs是一類長(zhǎng)度為19-22核苷酸(nt)的內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，它通過與靶m

2、RNA3'UTR區(qū)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，參與蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)系統(tǒng)分化、發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮重要的作用。我們對(duì)于其在腦出血發(fā)生發(fā)展中的作用還了解甚少，國(guó)內(nèi)外鮮有相關(guān)研究。基于這種現(xiàn)狀，本研究對(duì)腦出血水腫期患者應(yīng)用芯片雜交的方法檢測(cè)其外周血特異性miRNAs表達(dá)譜，以發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)的miRNAs，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)部分特異性表達(dá)的miRNAs可能的靶基因，挑選出預(yù)測(cè)靶基因與腦水腫相關(guān)的miRNAs并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒

3、光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，分析選擇的miRNAs與腦水腫之間是否具有相關(guān)性，以期望發(fā)現(xiàn)外周血中可預(yù)測(cè)腦水腫的特異性miRNAs類生物標(biāo)記物，闡明腦出血后水腫可能的分子機(jī)制，從而為腦出血后灶周水腫的監(jiān)測(cè)和治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、本研究收集了8例基底節(jié)區(qū)高血壓性腦出血患者的血清，其中男性4例，女性4例，年齡57.37±9.67歲間，彼此無親緣關(guān)系;收集了4例年齡、性別匹配的

4、正常對(duì)照人群的血清，其中男性2例，女性2例，年齡60.75±7.69歲間，彼此無親緣關(guān)系。提取血清中總RNA，經(jīng)質(zhì)控合格后利用miRNA微陣列芯片技術(shù)對(duì)腦出血患者與正常對(duì)照之間差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行篩選。篩選差異表達(dá)的miRNAs的標(biāo)準(zhǔn)為:上調(diào)的Fold change值＞1.5，P＜0.05;下調(diào)的Fold change值＜0.6，P＜0.05。
　　2、分別應(yīng)用miRecords數(shù)據(jù)庫(kù)和靶基因預(yù)測(cè)軟件，預(yù)測(cè)部分差異表達(dá)的mi

5、RNAs的靶基因、分析靶基因參與的生物學(xué)功能，探討miRNAs與腦水腫相關(guān)的作用通路。
　　3、進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，采用RT-PCR方法對(duì)miR-126、miR-146a、miR-let-7a及miR-26a在腦出血、對(duì)照組的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，其中包括27例ICH患者、11例健康對(duì)照。最后，應(yīng)用Spearman法分析其與腦出血后第1天及3-4天的腦水腫程度的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1、miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果表明存在

6、腦出血特異性的miRNA表達(dá)譜;共篩選出65個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中64個(gè)miRNA下調(diào)，1個(gè)miRNA上調(diào)。
　　2、靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果:利用生物信息學(xué)方法對(duì)選擇的miR-126、miR-146a、miR-let-7a及miR-26a進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，涉及與腦水腫相關(guān)的靶基因有VCAM1，SPRED1，PIK3R2，SMAD4，TRAF6，CFH，IRAK-1，IL-6，IL-8等。差異表達(dá)的miRNA靶基因的生物學(xué)功能包括加重炎

7、癥反應(yīng)、促進(jìn)白細(xì)胞活化(miR-126，miR-146a)，參與氧化應(yīng)激(miR-146a)，凋亡(miR-let-7a)及平滑肌細(xì)胞增殖分化(miR-26a)等。
　　3、擴(kuò)大樣本量，qRT-PCR法證實(shí)miR-126、miR-146a、miR-let-7a及miR-26a在腦出血組中均下調(diào)，與對(duì)照組相比相對(duì)表達(dá)量分別為0.56、0.52、0.50、0.51，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通過上述miRNAs與腦水腫的相關(guān)性

8、分析發(fā)現(xiàn)miR-126與腦出血發(fā)病當(dāng)天及3-4天后腦水腫程度負(fù)相關(guān)（r=-0.552，P=0.003;r=-0.714，P＜0.001），而miR-146a、miR-let-7a及miR-26a則與腦水腫沒有相關(guān)性。
　　研究結(jié)論：
　　1、建立了腦出血患者和健康對(duì)照者之間血清miRNA的差異表達(dá)譜。
　　2、生物信息學(xué)分析顯示miR-126、miR-146a、miR-let-7a及miR-26a可能通過調(diào)控其靶基因的