胎盤特異性microRNA-518b在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、前言:
　　 胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞在人類妊娠早期胚泡植入過程中發(fā)揮著重要作用,滋養(yǎng)細(xì)胞功能(包括增殖、凋亡、侵襲和遷徙等)適度是生理妊娠建立、維持和適時終止的關(guān)鍵。功能過強(qiáng)可發(fā)生滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(如葡萄胎、絨癌等);過弱則可導(dǎo)致妊娠失敗(如自然流產(chǎn)、早產(chǎn)等)和病理妊娠(如子癇前期、IUGR等)。
　　 瘦素是由肥胖基因編碼的分泌性蛋白質(zhì),主要由白色脂肪組織產(chǎn)生,是一種作用于多靶器官、多功能的脂肪細(xì)胞因子。它參與糖代謝、胰島素分泌、青

2、春期發(fā)育及生殖調(diào)節(jié)、甲狀腺功能調(diào)節(jié)、骨代謝、肝臟代謝等。大量研究已證實,妊娠期瘦素水平較非妊娠時升高。近年來有資料顯示瘦素可促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡功能,并參與了促進(jìn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的過程。
　　 MicroRNA(miRNA)是一類長約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA,廣泛存在于線蟲到人類的真核生物體內(nèi)。miRNA可以通過與靶tuRNA的3'UTR完全或不完全互補(bǔ)配對結(jié)合,導(dǎo)致靶基因降解或抑制其蛋白質(zhì)翻譯,從而參與基因

3、的表達(dá)調(diào)控,在發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及癌癥的發(fā)生。隨著人們對miRNA研究的不斷深入,科學(xué)家們預(yù)測在人類存在1000多種miRNA分子,1/3的基因表達(dá)受到miRNA調(diào)控。
　　 關(guān)于人類胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)與分泌miRNA的研究剛剛起步。2004年,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)某些miRNA在小鼠和人的胎盤中存在高表達(dá),提示miRNA可能在胎盤生長發(fā)育過程中發(fā)揮了一定的作用。近年來,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一類miRNA可能是“胎盤特異性miRNA”(pl

4、accnta-spccificmicroRNA,PSmiRNA)。這類PSmiRNA傾向于只在胎盤表達(dá),并可能在胎盤發(fā)育不良相關(guān)的妊娠合并癥的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。2009年,LuoSS等發(fā)現(xiàn)并在驗證了8種PSmiRNA,包括PSmiR-512-3p、PSmiR-517a、PSmiR-517b、PSmiR-518b、PSmiR-519a、PSmiR-1185、PSmiR-1283以及PSmiR-1323。
　　 那么這8種PS

5、miRNA是否參與了妊娠早期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)呢?遺憾的是,至今未有研究報道任何miRNA對妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞牛物學(xué)行為的調(diào)控作用。本研究將通過檢測不同侵襲、增殖、凋亡能力的妊娠早期胎盤組織中此8種PSmiRNA的表達(dá)量及表達(dá)部位;研究初步回答了這個問題。本研究旨在探討PSmiR-518b與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞牛物學(xué)功能之間的關(guān)系及分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 第一部分:應(yīng)用熒光實時定量RT-PCR法,絕對定量8種PSmiR

6、NA在以下三個不同分組中的表達(dá)量是否有差異:
　　 1、以妊娠周數(shù)作為匹配條件,留取妊娠6～12周,自然流產(chǎn)患者(自然流產(chǎn)組)和正常妊娠人工流產(chǎn)(對照組)婦女胎盤絨毛組織。兩組患者妊娠周數(shù)、年齡等無統(tǒng)計學(xué)差異。2、葡萄胎(葡萄胎組)和正常妊娠人工流產(chǎn)(對照組)的婦女胎盤絨毛組織。3、以妊娠周數(shù)作為匹配條件,留取正常妊娠人工流產(chǎn)婦女的胎盤絨毛。分別于妊娠第6周、7周、8周、9周,取重量最大的胎盤絨毛10個(H組)與重量最小的胎盤絨

7、毛10個(L組)。相同孕周的兩組絨毛的重量有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 應(yīng)用熒光原位雜交法,觀察差異表達(dá)的PSmiRNA在早孕胎盤絨毛中的表達(dá)部位。找到表達(dá)量及表達(dá)部位均有意義的PSmiRNA。
　　 第二部分:體外培養(yǎng)HTR-8/Svneo滋養(yǎng)細(xì)胞,脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染差異表達(dá)的PSmiRNA的模擬物(mimics)和阻遏物(inhibitor)進(jìn)入HTR-8/Svneo細(xì)胞?；罴?xì)胞計數(shù)法及MTT比色法檢測不同分組的HTR-

8、8/Svneo細(xì)胞的增殖情況,Transwell法觀察HTR-8/Svneo細(xì)胞侵襲能力的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后HTR-8/Svneo細(xì)胞凋亡能力的變化。
　　 第三部分:生物信息學(xué)軟件預(yù)測差異表達(dá)的胎盤特異性microRNA的潛在的靶基因。通過熒光素酶活性分析及westernblot進(jìn)一步驗證此差異表達(dá)的胎盤特異性microRNA的靶蛋白。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:我們利用quantitativer

9、eal-timeRT-PCR方法檢測8種PSmiRNA在具有不同增殖、凋亡及侵襲能力的胎盤絨毛中的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)PSmiR-518b在傾向于增殖、侵襲不足而凋亡過度的自然流產(chǎn)組中表達(dá)增高,而在傾向于增殖、侵襲增強(qiáng)而凋亡不足的葡萄胎組中表達(dá)降低;在傾向于增殖不足、凋亡增強(qiáng)的“絨毛重量較小組”中表達(dá)增高,而在傾向于增殖增強(qiáng)、凋亡不足的“絨毛重量較大組”中表達(dá)降低;且在“出牛體重大于胎齡兒組”較“出牛體重小于胎齡兒組”表達(dá)明顯減少。進(jìn)一步的熒光

10、原位雜交觀察PSmiR-518b在胎盤絨毛組織中的表達(dá)部位發(fā)現(xiàn),PSmiR-518b幾乎只在絨毛末端的“滋養(yǎng)細(xì)胞層”(胎盤功能的主要行使者)中陽性表達(dá),“絨毛間質(zhì)”中無表達(dá),提示PSmiR-518b可能與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能密切相關(guān)。
　　 第二部分:瞬時轉(zhuǎn)染PSmiR-518b的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70-80%,轉(zhuǎn)染入PSmiR-518b-mimics的M組HTR-8/Svneo細(xì)胞中PSmiR-518b表達(dá)明顯上調(diào),是對照組的12.1

11、0±0.25倍(P＜0.001),轉(zhuǎn)染入PSmiR-518b.inhibitor的Ⅰ組HTR-8/Svneo細(xì)胞中PSmiR-518b的表達(dá)水平明顯下調(diào),是對照組的0.09±0.01倍(P＜0.001),轉(zhuǎn)染入PSmiR-518b-mimicsnegative及miR-518b-inhibitornegative的Mn組、Inc組HTR-8/SVneo細(xì)胞與對照組HTR-8/Svnco細(xì)胞之間的PSmiR-518b表達(dá)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(

12、圖2-1)。表明PSmiR-518b-mimics明顯增加了HTR-8/Svneo細(xì)胞中PSmiR-518b的表達(dá),而PSmiR-518b-inhibitor則明顯抑制了PSmiR-518b的表達(dá)。轉(zhuǎn)染了PSmiR-518b-mimics的M組細(xì)胞增殖能力變?nèi)?在轉(zhuǎn)染后24小時、48小時和72小時,活細(xì)胞計數(shù)較轉(zhuǎn)染了PSmiR-518b-inhibitor的Ⅰ組明顯減少、吸光度明顯降低(P＜0.01)。提示PSmiR-518b可以抑St

13、JHTR/svneo細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了PSmiR-518b-mimics的M組細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞明顯增多(P＜0.01),而PSmiR-518b-inhibitor則明顯抑制了HTR-8/Svneo細(xì)胞的凋亡。提示PSmiR-518b可以促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染PSmiR-518b-mimics后的transwell實驗中侵襲能力明顯變?nèi)?M組HTR-8/SVneo細(xì)胞穿出transewell小室

14、的細(xì)胞數(shù)量明顯低于I組(P＜0.01)。提示PSmiR-518b可以抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞的侵襲能力。
　　 第三部分:我通過牛物信息學(xué)軟件預(yù)測PSmiR-518b的潛在的靶基因。發(fā)現(xiàn)多種與發(fā)現(xiàn)多種與細(xì)胞侵襲、增殖、凋亡密切相關(guān)的基因。其中一種可能的靶基因——瘦素(Leptin,LEP)引起我們的注意:有大量高質(zhì)量文獻(xiàn)報道LEP可促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖功能[20],抑制其凋亡功能[21],并參與了促進(jìn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的過

15、程[22]。LEP對妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞牛物學(xué)功能的影響方向均與我實驗第一、二部分中PSmiR-518b對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響方向相反。因此我們初步選定LEP進(jìn)行下一步的靶基因鑒定實驗。隨后的熒光素酶活性分析實驗發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染LEP3'UJTR熒光素酶載體和PSmiR-518b表達(dá)載體組的報告基因活性相對于對照組顯著降低,在PSmiR-518b的作用下,LEPYUTR熒光素酶載體的熒光活性下調(diào)大于75%。由此證明,LEP3'UTR區(qū)可被PSmi