MicroRNA在子癇前期胎盤組織中的表達及功能研究.pdf

1、子癇前期（Preeclampsia,PE）是人類妊娠期特有的常見病和多發(fā)病。在我國，其發(fā)生率為9.7％，在孕產(chǎn)婦死亡原因中占第二位，嚴重威脅母嬰健康。目前，PE的病因和發(fā)病機理仍未闡明，研究表明胎盤滋養(yǎng)細胞功能障礙是PE發(fā)病的病理基礎(chǔ)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過與靶mRNA完全或不完全互補配對，導(dǎo)致靶基因降解或抑制其翻譯，從而在基因的表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。最近有研究表明在

2、人類子癇前期胎盤與正常胎盤組織中，miR-210與miR-182的表達水平存在差異，提示miRNA的表達失衡可能參與了PE的發(fā)病過程。但以往研究檢測的miRNA數(shù)量有限，并且國內(nèi)外尚無miRNA在PE胎盤組織中功能研究的報告。因此有必要深入開展miRNA在PE胎盤組織中的表達和功能研究，為深入研究PE的發(fā)病機理提供新的線索。
　　目的
　　1.了解miRNA在正常與PE胎盤組織中的表達差異，進一步篩選與PE發(fā)病相關(guān)的miRN

3、A。
　　2.了解miRNA的作用靶點以及對胎盤滋養(yǎng)細胞功能的調(diào)控作用，探討miRNA在PE發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法
　　1.應(yīng)用Exiqon8.1版的miRNA表達譜芯片篩選8對重度PE胎盤與正常胎盤組織中差異表達的miRNA，并采用TargetScan與PITA預(yù)測系統(tǒng)篩選差異miRNA的靶基因。
　　2.選取10個miRNA，應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR（Real-timeRT-PCR）方法加以驗證，分

4、別定量檢測miRNA在15例重度子癇前期患者（sPE組）、8例輕度子癇前期患者（mPE組）及11例正常妊娠胎盤組織（對照組）中的表達水平。
　　3.選擇PE與正常胎盤組織中表達差異較為顯著的miR-152進行靶基因驗證。采用miRNA過表達技術(shù)在人滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系（JEG-3）中過表達miR-152，RT-PCR與免疫印跡（Westernblot）技術(shù)驗證其靶基因的表達水平，并通過熒光素酶報告系統(tǒng)進一步驗證其作用位點。
　

5、　4.在JEG-3細胞中過表達miR-152，檢測JEG-3細胞浸潤能力的變化，并檢測NK-92MI細胞殺傷JEG-3細胞的能力是否改變。
　　結(jié)果
　　1.芯片結(jié)果顯示：重度子癇前期胎盤與正常胎盤組織中存在34個差異表達的miRNA，其中，11個miRNA在sPE胎盤組織中表達升高，23個miRNA表達下降。通過靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)：在miR-30a-3p、miR-152與miR-18a的可能的作用靶點中，分別包括IGF1、HL

6、A-G與ESR1等與PE發(fā)病相關(guān)的基因。
　　2.選取10個miRNA，應(yīng)用Real-timeRT-PCR進行驗證，其中8個miRNA與芯片結(jié)果相符：miR-210、miR-152與miR-518b在sPE胎盤中表達升高（P<0.05），miR-377、miR-411、miR-542-3p、miR-18a與miR-363在sPE胎盤中表達下降（P<0.05）；miR-152在mPE胎盤組織中表達升高（P<0.05），miR-210

7、、miR-377、miR-411在mPE中表達下降（P<0.05）。
　　3.將pre-miR-152轉(zhuǎn)染入JEG-3細胞，使JEG-3細胞中的miR-152表達升高，RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前后JEG-3細胞中HLA-GmRNA的水平無顯著差異（P>0.05），但Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)在JEG-3中過表達miR-152之后，HLA-G的蛋白表達水平明顯下降（P<0.05）。采用pMIR-REPORT熒光素酶報告基因系統(tǒng)進

8、行靶點驗證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pre-miR-152與重組載體的實驗組其熒光素酶活性下降約47％，表明HLA-G為miR-152的作用靶點。
　　4.細胞浸潤實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-152前后，JEG-3細胞的浸潤能力無顯著改變（P>0.05）。然而，在JEG-3細胞中過表達miR-152之后，NK-92MI細胞對JEG-3細胞的殺傷能力顯著提高（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1.子癇前期胎盤組織中存在一系列表達失衡的miR