補腎清毒法對慢性乙型肝炎患者外周血特異性CTL影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　大量研究表明，中醫(yī)藥在治療慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Viral Hepatitis B，CHB)方面有著獨特優(yōu)勢。補腎清毒法源于中醫(yī)伏氣理論“腎虛疫毒內(nèi)伏肝血”。通過檢測補腎清毒法治療CHB患者前后外周血HBcAg18-27表位特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的數(shù)量和功能，探討補腎清毒法對CHB患者外周血特異性CTL的影響，部分闡明補腎清毒法抗HBV可能的作用靶

2、點和免疫活化機制，探析慢性乙型肝炎腎虛邪伏理論的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵，為補腎清毒法治療慢性乙型肝炎提供較為全面的科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診隨訪的CHB患者，應(yīng)用HLA-A2作為過篩指標，經(jīng)流式細胞術(shù)直接熒光免疫法篩選HLA-A2陽性CHB患者共32例，所有入選的HLA-A2陽性CHB患者隨機分為西藥組15例和中西藥組17例。另設(shè)10例HLA-A2陽性健康獻血者為正常對照組。西藥組予拉米夫定治療

3、，中西藥組在拉米夫定治療基礎(chǔ)上加用補腎清毒法。
　　2.采集正常組、中西藥組、西藥組入組時和治療6個月后外周靜脈血20ml，用密度梯度離心法分離得到外周血單個核細胞(PBMC)，并凍存于液氮中。
　　3.細胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，采用MHC I-五聚體(Pentamer)染色流式檢測技術(shù)直接檢測HBcAg18-27表位特異性CTL的細胞數(shù)量。
　　4.細胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，采用MHC I-五聚體(Pentamer)結(jié)合胞內(nèi)細胞因子(I

4、CS)染色流式檢測技術(shù)，檢測HBcAg18-27表位特異性CTL細胞毒效應(yīng)分子穿孔素(Perforin)、顆粒酶B(Granzyme B)和細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)的表達。
　　5.細胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，采用酶聯(lián)免疫吸附斑點試驗(Enzyme Linked ImmunologicSpot Assay，ELISPOT)技術(shù)測定經(jīng)HBcAg18-27I肽段誘導(dǎo)特異性CTL分泌IFN-γ的應(yīng)答頻率和平均反應(yīng)強度。
　　結(jié)果：

5、r>　　1.補腎清毒法對外周血HBcAg18-27表位特異性CTL細胞數(shù)量的影響
　　治療前，中西藥組和西藥組特異性CTL細胞的頻率（Pentamer+細胞數(shù)占CD3+CD8+雙陽性細胞總數(shù)比例）較正常組高（P＜0.05);與治療前相比，中西藥組和西藥組治療后特異性CTL細胞的頻率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;和西藥組相比，中西藥組特異性CTL細胞的頻率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.補腎

6、清毒法對外周血HBcAg18-27表位特異性CTL細胞功能的影響
　　(1)Pentamer結(jié)合ICS染色流式檢測細胞毒效應(yīng)分子Perforin、Granzyme B和細胞因子IFN-γ的表達
　　Perforin:治療前，中西藥組和西藥組特異性CTL細胞Perforin表達頻率（Pentamer+Perforin+細胞數(shù)占CD3+CD8+細胞總數(shù)的比例）較正常組高（P＜0.05)，但兩治療組總體頻率偏低;與治療前相比，中西

7、藥組和西藥組治療后特異性CTL細胞Perforin表達的頻率上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，但總體表達頻率仍偏低;治療后，西藥組和中西藥組特異性CTL細胞Perforin的表達頻率相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　Granzyme B:治療前，中西藥組、西藥組和正常組特異性CTL細胞Granzyme B表達頻率（Pentamer+Granzyme B+細胞數(shù)占CD3+CD8+細胞總數(shù)的比例）均偏低;與治療前相比，中西藥組和西藥

8、組治療后特異性CTL細胞Granzyme B表達的頻率上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，但總體表達頻率仍偏低;治療后，西藥組和中西藥組特異性CTL細胞Granzyme B的表達頻率相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　IFN-γ:治療前，中西藥組和西藥組特異性CTL細胞IFN-γ的表達頻率（Pentamer+IFN-γ+細胞數(shù)占CD3+CD8+細胞總數(shù)的比例）較正常組高（P＜0.05）;與治療前相比，中西藥組和西藥組治療后特異性CT

9、L細胞IFN-γ的表達頻率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05);和西藥組相比，中西藥組特異性CTL細胞IFN-γ的表達頻率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。
　　(2)ELISPOT法測定經(jīng)HBcAg18-27I肽誘導(dǎo)特異性CTL分泌IFN-γ的應(yīng)答頻率和平均反應(yīng)強度
　　治療前，中西藥組和西藥組特異性CTL細胞對HBcAg18-27I表位肽的應(yīng)答頻率和平均反應(yīng)強度較低，兩組間差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)

10、;與治療前相比，中西藥組和西藥組治療后特異性CTL細胞對HBcAg18-27I表位肽的的應(yīng)答頻率和平均反應(yīng)強度有所上升，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);和西藥組相比，中西藥組特異性CTL細胞對HBcAg18-27I表位肽的的應(yīng)答頻率和平均反應(yīng)強度均較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.治療前，中西藥組和西藥組CHB患者特異性CTL細胞的數(shù)量和表達細胞因子水平偏低，我們認為，這與CHB患者特異性

11、CTL免疫功能障礙有關(guān)。正常健康人群特異性CTL水平也較低，這可能由于健康人循環(huán)血中不存在HBV特異性抗原的持續(xù)刺激，導(dǎo)致HBV特異性CTL水平偏低。
　　2.補腎清毒法治療后CHB患者外周血特異性CTL細胞數(shù)量明顯上升。Perforin、Granzyme B雖有上升，但總體表達頻率仍偏低，而IFN-γ則總體表達頻率升高明顯，表明HBV特異性CTL的非胞毒途徑可能在清除病毒中發(fā)揮更重要作用。補腎清毒法通過增加特異性CTL細胞數(shù)量和