越橘變異株生物學特性及ISSR分子標記研究.pdf

1、越橘（Vaccinium vitis-idaea Linn.），俗稱藍莓，為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬（Vaccinium Linn.）灌木或小喬木。全世界越橘屬植物約有450個種，我國已知有91個種，28個變種，主要分布在我國東北和西南地區(qū)。北美地區(qū)既是越橘原產地也是主要產區(qū)。越橘果實為藍色小漿果，富含多種維生素、黃酮、花青素，具有顯著提高視力和抗癌保健功效，近年來世界各地需求量不斷增加。
　　南高叢越橘品種V3及Le

2、gacy引種西南地區(qū)多年，V3長勢旺盛，但果實很?。籐egacy果實中等，長勢較為旺盛，但在重慶每年春夏梅雨季節(jié)，葉片易出現大量褐色病斑，抗病性較差。由于多倍體植株具有器官巨大性、抗性增強及營養(yǎng)成分增加等特點，本實驗室連續(xù)若干年采用秋水仙堿對北高叢、南高叢越橘不同品種進行加倍，陸續(xù)得到了不同表型的變異植株。在誘變初期雖已經對變異株的形態(tài)學及細胞學進行了分析鑒定，但在田間栽培過程中，變異株還陸續(xù)有新的表型特征出現。加倍后的多倍體回復突變問

3、題一直是研究中的空白領域，植株在回復突變中的生物學特性及分子水平的變化等指標的記錄是進行基礎研究的重要數據。因此，本研究運用ISSR分子標記技術在DNA水平對變異株進行分析，并結合形態(tài)學和細胞學檢測方法對變異植株與正常植株的解剖結構、生理指標、染色體數目進行分析研究和差異顯著性比較，進一步確認變異株在回復突變過程中的各方面指標的變化，旨在為越橘的多倍體育種提供基礎研究數據。
　　主要研究結果如下：
　　1.V3變異株移栽田間

4、生長三年后，形態(tài)學鑒定顯示：平均高度為對照的110％，莖直徑為對照的132%，葉長、葉寬為對照的144%、137%。與對照相比，變異株長勢更好但果實較小，三棵變異株之間無顯著差異。Legacy經秋水仙素誘變后，根據表型特征分為L1、L2兩種類型。L1變異株表現多倍體的特性，經鑒定：莖粗，葉長、葉寬與對照相比分別增加了40%、56%、52%，為顯著差異；L2變異株為分枝量增大類型，移栽田間后株高相比對照下降32.5%，分枝量增加194.4

5、%，為極顯著差異，葉長寬分別增加34%、38%，與對照相比差異顯著。
　　2.經葉表皮氣孔觀察，氣孔密度方面：V3變異株下降20.5%；L1變異株下降11.6%，與對照相比差異顯著；保衛(wèi)細胞葉綠體數目：V3變異株增加14.6%，L1變異株增加35.6%，L2變異株增加24.6%，與對照相比均為顯著差異。氣孔保衛(wèi)細胞平均長度、寬度：L1變異株分別增加16.7%、18.4%，與對照差異顯著；V3、L2與對照相比差異不顯著。兩個品種的變

6、異株葉片橫切結構顯示：葉片主脈直徑、上表皮厚度、柵欄組織及海綿組織厚度均顯著增加，Legacy變異株的葉片結構緊密度（CTR）與對照在5%水平上存在差異，柵/海比明顯高于對照，表明Legacy變異株抗旱能力較對照有增強。
　　3.去壁低滲火焰干燥法對變異株莖尖染色體鑒定結果表明：越橘V3及L1變異株均為二倍體細胞和四倍體細胞共存的嵌合體，多倍體細胞比率分別為：45.52%、38.62%，較其誘導初期鑒定結果（70%、49.06%）

7、相比呈下降趨勢，表明在越橘異倍型嵌合體中，二倍體細胞分裂增殖速度較四倍體細胞快，加倍后有回復突變傾向。
　　4.V3變異株的葉綠素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量均較對照顯著增加，丙二醛含量顯著下降；Legacy變異株的葉綠素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量均較對照增加，丙二醛含量下降，呈極顯著差異。表明變異株具有生長優(yōu)勢，抗逆性更強。
　　5.采用改良CTAB法獲取高質量越橘DNA。通過直觀分析和方差分析結合,建立了越橘ISS

8、R-PCR（20μl）最佳反應體系，各組分的濃度為：10×buffer2μl；Taq酶0.75U；Mg2+1.875mmol.L-1；DNA80ng；dNTP0.1mmol.L-1；引物0.2μmol.L-1。在此基礎上探討了引物UBC835的最佳退火溫度、循環(huán)次數和延伸時間，結果分別為54.2℃、35次、60s。電泳結果顯示優(yōu)化體系穩(wěn)定性較高。
　　6.對V3、Legacy變異株及在田間栽培中出現表型變異的南高叢品種-南好變異株

9、（B1、B2、B3）及10個由本實驗室長期栽培保存的北高叢和南高叢越橘品種共21個樣品進行ISSR多態(tài)性擴增。從70個ISSR引物中篩選出10個多態(tài)性高且較穩(wěn)定的引物，共擴增出95個位點，多態(tài)性位點90個，多態(tài)比率為94.70%。UPGMA聚類顯示21個樣品的遺傳距離介于0.57~0.83，均值0.7，在系數0.57處材料被分為南北高叢兩大分支。3個品種的變異株均表現出很高的多態(tài)性。與對照株相比，變異株在ISSR-PCR擴增中的條帶差異