胃癌干細胞亞群生物學(xué)特性及分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)性死亡的第二原因，盡管有先進的診斷工具和治療方法，由于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥，胃癌患者的五年的生存率仍不到30％。因此胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥仍是限制其療效的主要因素。尋找高度特異性治療靶標是提高胃癌療效乃至根治的重要途徑，為研究胃癌的發(fā)生和發(fā)展機制開辟了新途徑。
　　近年來興起腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)理論為該途徑提供了新的思路。胃癌干細胞(gastric cancer stem

2、 cells，GCSCs)是胃癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要因素，對其進行研究，尋找和鑒定特異性的GCSCs的分子標志物，并且明確其相關(guān)分子的調(diào)控機制。
　　在本研究中，我們使用流式細胞熒光分選和無血清成球培養(yǎng)的方法，從胃癌細胞系中分離/富集了胃癌干細胞亞群CD44和CD90，實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)胃癌細胞系SNU-5和SNU-16中CD44和CD90陽性細胞高表達干性相關(guān)基因Sox2、Oct-4和Nanog;無血清成球培養(yǎng)

3、實驗表明SNU-5和SNU-16中CD44和CD90的陽性細胞的成球能力明顯強于其陰性細胞;移植瘤實驗也表明同數(shù)量級的SNU-5和SNU-16中CD44和CD90的陽性細胞較其陰性細胞具有更強的腫瘤形成能力，上述結(jié)果從干性基因表達、自我更新能力和致瘤性等幾個主要方面證實了胃癌細胞系SNU-5和SNU-16中CD44和CD90陽性細胞具有CSCs的特性。
　　體外Transwell小室侵襲實驗發(fā)現(xiàn)SNU-5和SNU-16的GCSCs

4、亞群CD44的陽性細胞較其CD90的陽性細胞具有更強的侵襲能力;而CCK8增殖實驗檢測表明SNU-5和SNU-16的GCSCs亞群CD90的陽性細胞較其CD44陽性細胞具有更強的增殖能力，同時CD44和CD90陽性細胞的體內(nèi)移植瘤實驗中，我們發(fā)現(xiàn)CD44陽性細胞形成的移植瘤浸潤周圍組織并有肺轉(zhuǎn)移，而CD90陽性細胞形成的移植瘤具有完整的包膜。我們進一步發(fā)現(xiàn)CD44陽性細胞呈EMT表型并具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能，CD90陽性細胞呈細胞周期表型具

5、有高致瘤性的特性。通過基因芯片分析，我們篩選出在GCSCs亞群CD44和CD90陽性細胞中一系列差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)ENO1在GCSCs亞群CD44陽性細胞中表達增高尤為突出，因此進一步研究了ENO1在調(diào)控GCSCs亞群CD44陽性細胞中自我更新及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的分子機制，并探討了其在胃癌標本中表達的臨床意義。
　　通過Western Blot檢測篩選出高表達ENO1的SNU-5和低表達ENO1的BGC-823的細胞模型

6、，同時流式細胞熒光分析發(fā)現(xiàn)ENO1在SNU-5的細胞膜富集表達，且SNU-5中ENO1與CD44陽性細胞具有共定位現(xiàn)象。利用慢病毒干擾SNU-5中CD44陽性細胞ENO1的表達后，可以顯著抑制SNU-5中CD44的陽性細胞的成球能力、成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力;發(fā)現(xiàn)過表達ENO1后增強BGC-823中CD44陽性細胞的成球能力、成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力。另外，本室制備靶向ENO1的功能性單抗21A3對SNU-5中CD44陽性細胞體外功能的影響

7、實驗表明，單抗21A3可以顯著抑制SNU-5中CD44的陽性細胞的成球和侵襲能力。對SNU-5中CD44陽性細胞和陰性細胞進行基因芯片及信號通路分析，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路改變最大。Western blot檢測在穩(wěn)定干擾ENO1的SNU-5中CD44陽性細胞的EMT標志物Vimentin表達降低及細胞周期蛋白Cyclin D1和C-myc的下調(diào)表達，以此同時E-cadherin和p21的上調(diào)表達，伴隨PI3K/Akt信號通路Akt

8、和PI3K的磷酸化水平降低，膜ENO1和膜uPA蛋白也伴隨下調(diào)，而過表達ENO1的BGC-823中CD44陽性細胞Akt和PI3K的磷酸化水平上升，同時膜ENO1和膜uPA蛋白也表達上升，提示ENO1的作用可能通過Akt信號通路激活。對95例胃癌標本免疫組化染色檢測結(jié)果顯示，與ENO1的表達成正相關(guān)，而與患者的生存時間成負相關(guān)，ENO1可以作為判斷胃癌預(yù)后的重要指標。
　　本文的主要結(jié)論如下:流式熒光分選和無血清成球培養(yǎng)是一種能夠