大鼠肝干細胞和肝癌干細胞間生物學特性差異分析及相關分子調控機制研究.pdf

1、【背景】
　　干細胞研究是近些年來的研究熱點，其中包括正常干細胞（normalstemcells,NSCs）和腫瘤干細胞（cancerstemcells,CSCs），針對這些干細胞的深入研究對于許多疾病的診治具有十分重要的意義。NSCs無論對于機體的正常功能維持，還是對于疾病的異常功能修復，都占據(jù)著至關重要的地位。干細胞治療是急、慢性終末期肝病最有前景的療法，可用于肝病治療的干細胞類型眾多，主要分為肝內干細胞和肝外干細胞兩類。胎肝

2、干/祖細胞（fetalliverstem/progenitorcells,FLSPCs）屬于肝內干細胞的典型代表，因其高存活、高增殖、小體積和高安全優(yōu)勢，成為干細胞治療肝病的理想細胞之一。本課題應用三步分離法富集了FLSPCs，獲得了與流式分選近似的分離效率。然而，要探索FLSPCs治療潛能，以下兩個問題急待解決：首先，如何保持FLSPCs自我更新；其次，如何促進FLSPCs準確分化為肝細胞和膽管細胞。
　　肝細胞癌(hepato

3、cellularcarcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是最易致死的癌癥類型，全世界每年新發(fā)HCC中的40％～50％在我國大陸。雖然近幾年HCC的診斷和治療得到了一些發(fā)展，但是闡明HCC的發(fā)生和轉移機理仍是解決HCC診治的根本途徑。HCC被推測起源于一小群細胞，這些細胞具有諸多類似干細胞的特征，因此被稱為肝癌干細胞（hepaticcancerstemcells,HCSCs）。HCSCs起源起源被認為是HCC的重要發(fā)生

4、機制之一，而HCC干細胞的來源之一被推測是正常肝干細胞（hepatcinormalstemcells,HNSCs）在誘癌因素刺激下發(fā)生惡性轉化所致。因此，對比HNSCs和HCSCs之間的生物學特性差異，對于理解兩者之間的相互關系具有重要意義。利用建立的干細胞分離法，本課題富集了HNSCs和HCSCs，對比了兩種干細胞之間的生物學特性差異，并建立了兩種干細胞間小RNA（microRNA,miRNA）和基因差異表達譜。
　　雖然HCS

5、Cs被推測來自于HNSCs的惡性轉化，但是尚缺乏實際性的生物轉化模型，同時參與該過程的具體分子機制尚不清楚。從獲得的miRNA差異表達譜中，本課題挑選了在HCSCs極度下調的miRNA，miR-200a進行了深入研究。我們發(fā)現(xiàn)HNSCs中抑制miR-200a的表達會促進細胞增殖明顯加快，并具有一定的侵襲和遷移能力，最終導致HNSCs發(fā)生惡性轉化成為類似HCSCs的細胞。雖然上述研究結果已在“StemCellRev”等多篇高水平國際雜志發(fā)

6、表，但是miR-200a缺失介導惡性轉化的分子機制尚不清楚。通過鑒定miR-200a缺失后影響的下游靶基因，我們發(fā)現(xiàn)ZEB作為miR-200a的靶基因參與了HNSCs向HCSCs惡性轉化的調控作用。為了分析失調性miRNAs作為診斷HCC的分子標志物的可能性，我們對二乙基亞硝胺誘導大鼠HCC發(fā)生的各個階段進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)miR-200a的失調早于AFP的變化，有望是一個潛在的標志物。
　　【目的】
　　總體目標是對比HN

7、SCs和HCSCs間的生物學特性，探索從HNSCs向HCSCs惡性轉化的分子機制。主要包括三個具體目標：（1）大規(guī)模培養(yǎng)FLSPCs并保持其未分化狀態(tài)，確定促進FLSPCs定向分化的優(yōu)化條件。（2）系統(tǒng)對比HNSCs和HCSCs間的生物學特性，建立HNSCs和HCSCs間差異基因和miRNA表達譜。（3）選取代表性的miRNA或者基因，探索其介導HNSCs向HCSCs惡性轉化過程中的部分關鍵分子機制。
　　【方法】
　　第一

8、部分：HNSCs和HCSCs的分離鑒定
　　1、FLSPCs的三步分離法富集（此部分已入碩士論文）
　　利用Percoll非連續(xù)密度梯度離心（percolldiscontinuousgradientcentrifugation,PDGC）、差異消化和差異貼壁（differentialtrypsinizationanddifferntialadherence,DTDA）、Percoll連續(xù)密度梯度離心（percollconti

9、nuousgradientcentrifugation,PCGC）三個系列步驟成功分離了FLSPCs。
　　2、HCSCs的三步分離法富集（此部分與王興碩士合作完成，詳見其論文）
　　利用二乙基亞硝胺造就Fisher344大鼠HCC模型，利用PDGC富集肝癌細胞（heptatictumorcells,HTCs），通過DTDA對分離的HTCs進行純化，采取PCGC從純化的HTCs根據(jù)密度大小不同富集HCSCs。
　　3、

10、正常肝邊緣（sidepopulationfromhepaticnormalcells,SP-HNCs）分離
　　四氯化碳造就Fisher344大鼠的肝損傷模型，刺激肝內干細胞動員，制備正常肝細胞（hepaticnormalcells,HNCs）的單細胞懸液。根據(jù)干細胞亞群具有主動外排染料特性，利用熒光激活的細胞分選術（fluorescenceactivatedcellsorting,FACS）富集邊緣群（sidepopulatio

11、n,SP）的方法分離SP-HNCs。
　　4、肝癌邊緣細胞（sidepopulationfromhepatictumorcells,SP-HTCs）分離
　　根據(jù)CSCs亞群具有主動外排染料的特性，將HTCs和Hoechst33342染料共孵育，設定SP的范圍所在，分離出SP-HTCs。
　　第二部分：HNSCs的擴增培養(yǎng)及誘導分化
　　1、建立FLSPCs的體外擴增體系
　　進行FLSPCs的有效擴增，并

12、保持其處于未分化狀態(tài)，我們將FLSPCs利用夾心法培養(yǎng)于上稀下密的雙層軟瓊脂之間，同時添加白血病分化抑制因子（leukaemiainhibitoryfactor,LIF）。培養(yǎng)一段時間，以貼壁培養(yǎng)的FLSPCs作為參照，分析FLSPCs經(jīng)過軟瓊脂擴增后，其干細胞特性是否發(fā)生變化。
　　2、建立FLSPCs的定向分化體系
　　單獨添加不同濃度的二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO），找到促進FLSPCs分化

13、為HNCs的最適宜DMSO濃度；單獨添加不同濃度的肝細胞生長因子（hepatocellulargrowthfactor,HGF），明確誘導FLSPCs分化為HNCs的最適宜HGF濃度；聯(lián)合添加HGF和DMSO誘導FLSPCs分化，與單獨誘導的效果對比，確定誘導FLSPCs分化的適合方案。
　　第三部分：HNSCs和HCSCs間的核酸差異譜
　　1、HNSCs和HCSCs間的miRNA差異譜
　　從SP-HNCs和SP-

14、HTCs中分別分離總RNA。通過miRNA微陣列技術對比兩種干細胞的miRNA表達差異，同時選取失調的代表性miRNAs，利用實時定量PCR技術驗證失調表達的可靠性。以上調兩倍、下調1/2作為失調的評判標準。
　　2、HNSCs和HCSCs間的基因差異譜
　　通過抑制性削減雜交技術對比SP-HNCs和SP-HTCs的基因表達差異，選取失調的代表性基因，利用實時定量PCR技術驗證失調表達的可靠性。以上調兩倍、下調1/2作為失調

15、的評判標準。
　　第四部分：HNSCs向HCSCs的惡性轉化
　　1、惡性轉化模型的建立
　　從SP-HNCs和SP-HTCs間miRNA差異表達譜中挑選出在SP-HTCs下調幅度最大的miR-200a。利用RNAi技術干涉FLSPCs中miR-200a的表達。通過實時定量和原位雜交技術驗證miR-200a的抑制效果。
　　2、惡性轉化效果的驗證
　　光學顯微鏡和透射電鏡觀察miR-200a抑制前后細胞的形

16、態(tài)變化；流式細胞技術等檢測細胞的增殖變化（包括細胞周期和細胞凋亡）；劃痕實驗和Transwell技術檢測細胞的侵襲、遷移能力變化；裸鼠皮下成瘤實驗，觀察miR-200a抑制前后細胞成瘤能力變化，以及細胞對受體肝臟的損害情況。
　　3、惡性轉化的分子機制
　　利用常用miRNA-靶基因預測系統(tǒng)預測miR-200a參與調控的基因；與建立的HNSCs和HCSCs間基因差異譜對比，挑選出可能的靶基因；通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和west

17、ernblotting等技術，驗證miR-200a調控的靶基因。
　　第五部分：MiR-200a與HCC發(fā)生的相關性分析
　　1、大鼠HCC模型的建立及階段的劃分
　　利用二乙基亞硝胺造就Fisher344大鼠HCC模型，根據(jù)病理學檢測結果，將整個HCC發(fā)生過程分為六個階段，依次為：正常肝階段、變性肝階段、纖維化階段、肝硬化階段、早期癌階段、晚期癌階段。
　　2、MiR-200a表達水平的檢測
　　分別收集

18、六個階段的組織和血清標本，組織標本利用原位雜交技術檢測miR-200a的表達，血清利用實時定量PCR技術檢測miR-200a的表達水。
　　3、MiR-200a與病理資料的相關性分析
　　分析各階段組織miR-200a表達水平與血清miR-200a表達水平之間的相關性；分析各階段中miR-200a表達水平與病理評分之間的相關性。
　　【結果】
　　第一部分：HNSCs和HCSCs的分離鑒定
　　1、FLSP

19、Cs的三步分離法富集（此部分已入碩士論文）
　　三步分離法富集的FLSPCs是位于PCGC分離后第一、二層的細胞。這些細胞個頭較小，具有較大的核/漿比，高表達干細胞標志CD133和CD49f，低表達成熟肝細胞標志，同時能夠自行分化為表達ALB的類成熟肝細胞。
　　2、HCSCs的三步分離法富集（此部分與王興碩士合作完成，詳見其論文）
　　三步分離法富集的HCSCs是位于PCGC分離后第三層的細胞。這些細胞具有較大的核/

20、漿比，高表達干細胞標志CD133和EpCAM，具有較強的體外增殖、侵襲、遷移、化療耐藥能力，體內移植該類細胞后其能快速在裸鼠皮下成瘤，同時遷移到肝臟形成腫瘤。
　　3、SP-HNCs的分離
　　SP-HNCs的比例約占HNCs的4％，這些細胞直徑約為7-15μm，具有較大的核/漿比，高表達干細胞標志，低表達成熟肝細胞標志，能夠被HGF誘導為表達ALB的類成熟肝細胞，體內移植SP-HNCs能修復鼠急性肝損傷。
　　4、S

21、P-HTCs的分離
　　SP-HTCs具有較大的核/漿比，高表達干細胞標志，具有較強的體外增殖、遷移能力，HGF誘導能促使該類細胞分化為低表達干細胞標志的HTCs，體內移植該類細胞后其能快速在裸鼠皮下成瘤，同時遷移到肝臟形成腫瘤。
　　第二部分：HNSCs的擴增培養(yǎng)及誘導分化
　　1、建立FLSPCs的體外擴增體系
　　與貼壁培養(yǎng)的FLSPCs相比，雙層軟瓊脂半懸浮培養(yǎng)的FLSPCs個頭更小、具有更大核漿比、形成

22、明顯的堿磷的強陽性克??；功能學方面：懸浮培養(yǎng)細胞穩(wěn)定表達干細胞表面標志CD49f和CD90、高表達未成熟肝細胞標志AFP、低表達率成熟肝細胞標志ALB。
　　2、建立FLSPCs的定向分化體系
　　促進FLSPCs分化為HNCs的最適宜DMSO濃度為1％；HGF的最適宜誘導濃度為20ng/ml；與單獨誘導對比，聯(lián)合HGF和DMSO能更好地誘導FLSPCs分化。
　　第三部分：HNSCs和HCSCs間的差異譜