cx43基因及csxnkx2.5基因與先天性心臟病關系的初步探討

1、復旦大學博士學位論文Cx43基因及Csx/Nkx2.5基因與先天性心臟病關系的初步探討姓名：陳萍申請學位級別：博士專業(yè)：婦產(chǎn)科學指導教師：常才20050418復旦^ 掌2 0 0 2 蛾博士畢業(yè)論。文 中文擅善照組：經(jīng)檢查沒有心臟畸形的正常人3 0 例，為正常志愿者和復旦大學附屬兒科醫(yī)院普通病房感染性疾病患兒。利用D N A 抽提試劑盒提取基因組D N A 。在C x 4 3 編碼序列兩側設計一對引物，擴增片段長度為1 3 4 8 b

2、p ，其中上游引物設計在內(nèi)含子中，以避免基因組中C x 4 3 假基因的非特異擴增，擴增出C x 4 3 全部編碼序列，以此產(chǎn)物作為模板巢式P C R 擴增編碼區(qū)的3 個相對較短的片段s 1 、s 2 、s 3 。對所有對象的3 個巢式P C R 的產(chǎn)物片段分別進行S S C P 分析；同時對所有研究對象的巢式P C R 產(chǎn)物進行測序。2 、收集復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院和鄭州市婦幼保健院，由于計劃生育或未婚先孕等原因，行口服米非司酮和米索

3、前列醇引產(chǎn)的正常胚胎或胎兒，共6 3 例，胎齡6 周一1 8 周， ( 相當于孕8 —2 0 周) 。胚胎6 周3 例，其余每周5 例。小鼠胚胎心臟標本：C D l 小鼠，購于中科院動物所( 0 0 0 4 7 5 1 ) ，9 4 只，雌鼠6 4只，雄鼠3 0 只。以觀察到雌鼠出現(xiàn)陰栓為胚胎( E m b r y o n i c D a y , E D ) 0 ．5 d ，分別在E D9 ．5 d 、1 0 ．5 d 、1 1 ．5

4、d 、1 2 ．5 d 、1 3 ．5 d 、1 4 ．5 d 、1 5 ．5 d 、1 6 ．5 d 處死孕鼠，采用頸椎脫位法處死孕鼠，P B S 液中解剖胚胎。用抗C x 4 3 多克隆一抗，采用免疫組化法顯示C x 4 3 基因在心臟的時空表達。3 、收集先心病心肌組織和外周血。( 1 ) 小兒組：復旦大學附屬兒科醫(yī)院心血管中心及新生兒病房的住院先心病1 2 6 例，男7 8 例，女4 8 例，年齡1 小時一1 4 ．5 歲，平均

5、2 歲3 月。均經(jīng)超聲心動圖、心導管檢查或外科手術確診。1 2 6例心臟畸形：法洛四聯(lián)征2 4 例；房間隔缺損2 7 例；室間隔缺損1 9 例；右室雙出口1 2 例；大動脈轉位6 例；心內(nèi)膜墊缺損9 例；肺動脈狹窄6 例；永存動脈干4 例；單心室、動脈導管未閉各3 例；右室發(fā)育不良、左室發(fā)育不良、孤立右位心各2 例；單心房、主動脈離斷、完全肺靜脈回流異常、主動脈縮窄、三尖瓣閉鎖、心脾綜合癥、十字交叉心各1 例。1 2 6 例中4 例有家

6、族史。 ( 2 )胎兒組及對照組見材料與方法l 。用抗C s x ／N k x 2 ．5 多克隆一抗，采用免疫組化法顯示C s x ／N k x 2 ．5 基因在心臟的時空表達。利用D N A 抽提試劑盒提取所有研究對象的基因組D N A ，分三段分別P C R 擴增C s x ／N k x 2 ．5 基因全部編碼序列。對所有研究對象的3 個片段分別進行S S C P 分析；對所有標本的片段1 進行D N A 序列測定。結果1 、1 6

7、 例先心病胎兒心肌組織中，發(fā)現(xiàn)一例患有右室雙出口、左心室左心房發(fā)育不良、主動脈狹窄合并房間隔缺損的胎兒存在C x 4 3 基因突變，共檢測到8 個突變位點，其中錯意突變：A r 9 9 2 2 T r p 、S e r 9 5 9 T h r 、A l a 9 6 4 P r o 、P r 0 1 0 5 5 L e u 、T h r l 0 7 6 A s n 。 同義突變：9 6 3 T - - + C9 7 5 T —C1 0 3