第二章 基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)

1、第二章 基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù),第一節(jié) 基因工程的理論基礎(chǔ),（一）原核生物的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn),1.操縱子結(jié)構(gòu),操縱子（Operon），由幾個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇排列而組成的一個(gè)基因表達(dá)的協(xié)同單位（coordinated unite），稱為操縱子。,一 基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn),調(diào)節(jié)基因 啟動(dòng)子 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因,大腸桿菌乳糖操縱子,色氨酸操縱子,2.原核細(xì)胞mRNA的特征,（1）半衰期短,（2）多順反子形式,（3）

2、存在SD序列,原核生物中起始密碼子AUG上游7～12個(gè)核苷酸序列因其與16SrRNA 3’末端反向互補(bǔ)而被認(rèn)為在核糖體-mRNA的結(jié)合過程中起作用。,（4）起始密碼子常為AUG（有時(shí)GUG，甚至UUG）。,3. 原核細(xì)胞基因的終止子,根據(jù)對(duì)細(xì)菌和噬菌體DNA模板上的終止信號(hào)的分析，發(fā)現(xiàn)它們具有共同的結(jié)構(gòu)特征：①終止點(diǎn)上游存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；②在終止點(diǎn)前面有一段由4～8個(gè)A

3、組成的序列，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端為寡聚U。,,,,,,,,,,,,U U U U U U U U U U U U,RNA,,（二）真核生物基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),1.真核生物基因的不連續(xù)性,斷裂基因（interrupted gene）,內(nèi)含子 是一個(gè)基因中非編碼DNA片段，它分開相鄰的外顯子。,外顯子 是一個(gè)基因中編碼蛋白序列。嚴(yán)格地說,外顯子是指保留在初級(jí)mRNA中不被剪切掉的區(qū)域,包括5’非翻譯區(qū)(5’UTR)、編碼序列和3’非翻譯區(qū)(3’

4、 UTR)。,外顯子-內(nèi)含子連接區(qū) 是指外顯子和內(nèi)含子的交界，又稱邊界序列。,GT-AG法則 序列分析表明，幾乎每個(gè)內(nèi)含子5’端起始的兩個(gè)堿基都是GT，3’端最后兩個(gè)堿基總是AG，由于這兩個(gè)堿基的高度保守性和存在的廣泛性，有人把它稱為GT-AG法則，即：5’ GT … AG 3’。,衛(wèi)星DNA 真核生物基因組中高度重復(fù)的DNA,有一些20～30bp的極短序列，且以數(shù)千個(gè)拷貝的串連方式排列，這種序列稱為衛(wèi)星DNA。,2.衛(wèi)星DNA,在

5、染色體DNA片段的氯化銫密度梯度離心中，由于浮力密度的不同，這種重復(fù)序列在主帶DNA附近出現(xiàn)的衛(wèi)星帶，因此稱之為衛(wèi)星DNA。,3.真核生物mRNA的特征,（1）5’端的帽子結(jié)構(gòu),幾乎全部的真核 mRNA 端都具“帽子”結(jié)構(gòu)。雖然真核生物的mRNA的轉(zhuǎn)錄以嘌呤核苷酸三磷酸（pppAG 或pppG）領(lǐng)頭，但在5’端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7GpppAGpNp）。mRNA5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。不同真核生物的mRN

6、A具有不同的帽子。,(1)有助于mRNA越過核膜，進(jìn)入胞質(zhì)；(2)保護(hù)5′不被核酶降解；(3)翻譯時(shí)供IFⅢ（起始因子）和核糖體識(shí)別，是翻譯所必需的。,（2）3’末端Poly（A）尾巴,除了組蛋白以外，真核生物mRNA 3’末端都有由40~200個(gè)A組成的Poly（A）尾巴。Poly(A)尾不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后的前體mRNA以ATP為前體，由RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，即Ploy (A)聚合酶催化聚合到3’末端。,Poly（A

7、）尾巴在基因工程操作中的作用：A、用Poly（T）作為合成cDNA第一鏈的引物。B、用Poly（T）純化柱從總RNA中分離mRNA,寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。,是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的形式；,它大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。,mRNA剛從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，其多聚(A)尾巴一般比較長(zhǎng)，隨著mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逗留時(shí)間延長(zhǎng)，多聚(A)逐漸變短消失，mRNA進(jìn)入降解

8、過程。,它可促進(jìn)核糖體的有效循環(huán)。,Poly（A）尾巴有三個(gè)方面的功能：,寡聚（dT）-纖維素柱層析法,常規(guī)方法,RNA(高鹽緩沖液),寡聚（dT）纖維素柱,低鹽溶液和蒸餾水,洗脫,較高純度的mRNA,,加樣,,,結(jié)合,Dynabeads　Oligo(dT)25是一種直徑為2.8μm的均一的、超順磁的微球體，其表面的5’連接鍵共價(jià)結(jié)合了由25個(gè)脫氧核糖核苷組成的長(zhǎng)鏈。,mRNA磁珠分離法,二 從DNA到蛋白質(zhì),（一）中心法則,1970

9、年特明(H.M. Temin)以在勞斯肉瘤病毒內(nèi)發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶這一成就進(jìn)一步發(fā)展和完善了“中心法則”。,（二）基因表達(dá),從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)。,DNA,,RNA,轉(zhuǎn)錄,,翻譯,蛋白質(zhì),原核生物和真核生物比較,1.啟動(dòng)子,2.RNA聚合酶,原核生物,真核生物,RNA聚合酶僅一種,RNA聚合酶有三種,全酶的組成是α2ββ'σ,3.表達(dá)過程,原核生物,真核生物,無細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同時(shí)進(jìn)行，基因表達(dá)的調(diào)控主要

10、發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。,有細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中，翻譯在細(xì)胞質(zhì)中，并且轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有加工過程，基因表達(dá)的調(diào)控可以發(fā)生在各種不同水平。,4.表達(dá)的調(diào)控,（1）真核生物的表達(dá)調(diào)控,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)錄因子,信號(hào)分子,,受體分子,,離子通道,第二信使分子,,,,蛋白激酶或磷酸酯酶活性,轉(zhuǎn)錄因子,,,,基因表達(dá),,（2）原核生物的表達(dá)調(diào)控,①代謝物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié),可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在

11、某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。,可阻遏調(diào)節(jié)中的基因平時(shí)都是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)和酶的工作過程中，但由于一些特殊代謝物或化合物的積累將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)，所以稱為可阻遏基因。,②弱化因子對(duì)基因活性的影響,③降解物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié),添加葡萄糖,能量得到滿足,細(xì)菌的腺苷酸環(huán)化酶,抑制,環(huán)腺苷酸(cMAP)↓,cAMP＋受體蛋白↓,調(diào)控的基因就不表達(dá),,,,,,④細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng),氨基酸饑餓,,空載tRNA,鳥苷四磷酸（ppGpp）鳥苷五

12、磷酸（pppGpp）,,,,關(guān)閉一些基因的表達(dá),開啟氨基酸合成基因的表達(dá),生產(chǎn)各種RNA、糖、脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學(xué)反應(yīng)過程均被停止,⑤環(huán)腺苷酸受體蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控,葡萄糖缺乏,,cAMP合成↑,,cAMP受體蛋白,,促進(jìn)RNA聚合酶結(jié)合一些基因的啟動(dòng)子,抑制RNA聚合酶結(jié)合一些基因的啟動(dòng)子,,總結(jié),基因工程操作中應(yīng)注意的真核生物與原核生物的差異,1.基因結(jié)構(gòu)的差異,2.啟動(dòng)子和RNA聚合酶的差異,3.蛋白質(zhì)的翻譯后修飾加工

13、（前體切割、二硫鍵、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、軟脂化）,4.基因表達(dá)的調(diào)節(jié)（表達(dá)量）,5.載體的差異,6.蛋白質(zhì)的純化方便,1．遺傳密碼與信息流 儲(chǔ)存在DNA上的遺傳信息通過mRNA傳遞給蛋白質(zhì)，mRNA與蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系是通過遺傳密碼的破譯來實(shí)現(xiàn)的。mRNA上每3個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這3個(gè)核苷酸就稱為密碼子，也叫三聯(lián)子密碼。蛋白質(zhì)是通過遺傳信息流由基因控制

14、的。,三 基因研究進(jìn)展,,2．結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因 結(jié)構(gòu)基因(structural gene)是可以轉(zhuǎn)錄成為各種RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)然后翻譯成多肽鏈，最終形成各種功能蛋白質(zhì)和酶。 從廣義上講，任何一種能夠調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因都可叫做調(diào)節(jié)基因(regulatory gene)，一般情況下則是指基因產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)別的基因活性的基因(如阻遏

15、基因等)。首先轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后由mRNA翻譯成阻遏蛋白質(zhì)或激活蛋白質(zhì)，通常也稱為轉(zhuǎn)錄因子或反式作用因子。它們通常結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因的非編碼區(qū)的順式元件上起調(diào)控作用。,3．管家基因和奢侈基因 具有相同遺傳信息的個(gè)體細(xì)胞間其所利用的基因并不相同，有的基因活動(dòng)是維持細(xì)胞基本代謝所必需的，而有的基因則在一些分化細(xì)胞或受到外界刺激的細(xì)胞中活動(dòng)。前者稱為管家基因(house-keeping gene)，如編碼核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖

16、酵解酶等的基因；而后者被稱為奢侈基因(1uxury gene)，,4．移動(dòng)基因1967年在大腸埃細(xì)菌的乳糖操作子的研究中第一次發(fā)現(xiàn)了稱為插入序列(insertion sequence，IS)的轉(zhuǎn)座因子。直至1980年夏皮羅(Shapiro)等人證實(shí)了可移位的遺傳基因存在，說明某些基因具有移動(dòng)性。轉(zhuǎn)座子也稱易位子，是由兩個(gè)重復(fù)順序夾著一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成。有的轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列就是IS。轉(zhuǎn)座子也和IS一樣，能從一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)座到另一個(gè)位點(diǎn)，

17、或從一個(gè)復(fù)制子轉(zhuǎn)座到另一個(gè)復(fù)制子。轉(zhuǎn)座子屬于可移動(dòng)的遺傳因子—移動(dòng)基因。除了轉(zhuǎn)座因子外，病毒和質(zhì)粒都是染色體外的可以移動(dòng)的遺傳物質(zhì)，都必須依賴宿主而復(fù)制。,5．重疊基因 核苷酸序列是彼此重疊的兩個(gè)基因稱為重疊基因(overlapping genes)或鑲嵌基因(nested genes)。,,,6．假基因 假基因是多基因家族中的成員，因其堿基順序發(fā)生某些突變而失去功能，不能表達(dá)或表達(dá)異常，生成無生物活性的多肽。假基因DN

18、A順序可在相應(yīng)基因名稱之前加φ表示，如α珠蛋白基因家族中φξ1與功能性ξ2 基因同源， φξ1有3個(gè)堿基被取代，其中密碼子6的GAG—TAG(谷氨酸→終止密碼)發(fā)生無義突變。,例如，在珠蛋白、免疫球蛋白、組織相容性抗原(histocompatibi1ity antigen)以及肌動(dòng)蛋白和微管蛋白等基因家族(gene family)中，都存在著這樣的功能失活的假基因。,(1)重復(fù)的假基因許多假基因都是同“親本基因”(Parental8e

19、ne)連鎖的，而且同其編碼區(qū)及側(cè)翼序列的DNA具有很高的同源佳?？梢姰a(chǎn)生此種類型的假基因拷貝的一種可能的機(jī)理是，由含有“親本基因”的染色體區(qū)段串聯(lián)重復(fù)形成，故稱之為重復(fù)的假基因。珠蛋白基因家族中的假基因即屬于這一種類型。,(2)加工的假基因除了重復(fù)的假基因外．在真核生物的染色體基因組中還存在著一類加工的假基因 (processed pseudogene)。這類假基因沒有與“親本基因”連鎖，而且其結(jié)構(gòu)是同轉(zhuǎn)錄本而非“親本基因”類似。例如

20、，它們都沒有啟動(dòng)子和間隔子，但在基因的3’—末端則都有一段延伸的腺嘌呤短序列，恰似mRNA分子3’—末端的poly(A)尾巴。這些特征表明，此類假基因很可能是來自加工的RNA之DNA拷貝，因此稱之為加工的假基因。,7．串聯(lián)基因簇 中度重復(fù)DNA有許多類型的重復(fù)序列組成。多重復(fù)序列組成的基因簇在重復(fù)區(qū)域的下游出現(xiàn)，這些通常是其產(chǎn)物需求量很高的基因，rDNA(編碼rRNA)就是其中一例。編碼18S、5.8S和28SrRNA的4

21、5S前體的基因就有約10～10000個(gè)拷貝的重復(fù)序列，其拷貝數(shù)因物種而異。人類基因組中45S基因在5個(gè)不同的染色體上都有排列，每一排列包含約40個(gè)拷貝。在分裂間期這些區(qū)域都處于核仁區(qū)，核仁是細(xì)胞核中的致密區(qū)域，是rRNA合成和修飾的工廠。另一個(gè)串聯(lián)基因簇的例子是組蛋白基因，其產(chǎn)物在S期大量產(chǎn)生，5種組蛋白基因在一個(gè)基因簇，有的可直接重復(fù)達(dá)數(shù)百次。,8．基因組基因組(genome)是1924年提出的，是指一個(gè)生物體、細(xì)胞器或病毒的全部基

22、因。原核生物基因組僅由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，它的基因組就是它的整個(gè)染色體。但對(duì)于二倍體的高等生物，能維持配子體正常功能的最低數(shù)目的一套染色體構(gòu)成的一個(gè)基因組。對(duì)于植物細(xì)胞而言，則有3個(gè)基因組，即染色體基因組(核基因組)、線粒體基因組和葉綠體基因組。,(1)原核生物基因組的特點(diǎn)原核生物基因組的特點(diǎn)包括：①具有操縱子結(jié)構(gòu)；②編碼序列在基因組中約占50％，遠(yuǎn)大于真核基因組，但又小于病毒基因組，編碼順序不重疊，其

23、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多為多順反子結(jié)構(gòu)；③多順反子結(jié)構(gòu)且無內(nèi)含子，是連續(xù)的，因此轉(zhuǎn)錄后不需要剪切；④基因組中重復(fù)序列很少，其結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝，只有編碼rRNA的基因往往是多拷貝的，有利于核糖體的快速組裝；⑤基因組中存在可移動(dòng)的DNA序列，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。,(2)真核生物基因組的特點(diǎn)①每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目，除了配子(精子和卵子)為單倍體外，體細(xì)胞一般為雙倍體，而原核生物的基因組則是單拷貝的；②真核生物的基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核

24、生物的基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，具有很多復(fù)制起點(diǎn)，每個(gè)復(fù)制子大小不一；③真核生物都有結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子(monocistron)，即一分子mRNA只能翻譯成一種蛋白；④大量重復(fù)順序的存在是真核生物基因組的重要特點(diǎn)；⑤真核生物基因組內(nèi)非編碼的順序占90％以上。⑥大多數(shù)真核生物的結(jié)構(gòu)基因具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，是斷裂基因。⑦有基因家族，來自同一個(gè)祖先基因的復(fù)制和變異、功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族，可以串聯(lián)