論文牛主要組織相容性復(fù)合體(mhc)酶聯(lián)免疫分析

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4、...啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊

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9、聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號(hào)：產(chǎn)品編號(hào)：CSBE11212b檢測(cè)范圍：檢測(cè)范圍：0.78ngml50ngml最低檢測(cè)限：最低檢測(cè)限：0.195ngml特異性：特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的牛MHC，且與其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。有效期：有效期：6個(gè)月預(yù)期應(yīng)用：預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定牛血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中MHC含量。說(shuō)明說(shuō)明1試劑盒保存：2

10、0℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；28℃（頻繁使用時(shí)）。2濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。3中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。4剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。概述概述主要組織相容性復(fù)合體（majhistocompatibilitycomplex，MHC），又稱(chēng)主組織相容性復(fù)合基因，是存在于大部分脊椎動(dòng)物基因組中的一個(gè)基因家族，與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。共分成

11、兩類(lèi)：第一型：MHCclassI（MHCI）位于一般細(xì)胞表面上，可以提供一般細(xì)胞內(nèi)的一些狀況，比如該細(xì)胞遭受病毒感染，則相病毒外膜碎片的氨基酸鏈透過(guò)MHC提示在細(xì)胞外側(cè)，可以供殺手T細(xì)胞等辨識(shí)，以進(jìn)行撲殺。第二型：MHCclassII（MHCII）只位于抗原提示細(xì)胞上，如巨噬細(xì)胞等。這類(lèi)提供則是細(xì)胞外部的情況，像是組織中有細(xì)菌侵入，則巨噬細(xì)胞進(jìn)行吞食后，把細(xì)菌碎片利用MHC提示給輔助T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被

12、微孔板，制成固相載體，往包被抗MHC抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗MHC抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MHC呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制1.酶聯(lián)板酶聯(lián)板(Assayplate)：一塊（96孔）。2.標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品（Stard

13、）：2瓶(凍干品)。3.樣品稀釋液樣品稀釋液(SampleDiluent)：120ml瓶。4.生物素標(biāo)記抗體稀釋液（生物素標(biāo)記抗體稀釋液（BiotinantibodyDiluent）：110ml瓶。5.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRPavidinDiluent）：110ml瓶。6.生物素標(biāo)記抗體（生物素標(biāo)記抗體（Biotinantibody）：1120μl瓶（1：100）7.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（

14、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（HRPavidin）：1120μl瓶（1：100）不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃60分鐘。3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡12

15、分鐘，200μl每孔，甩干。4.每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）100μl，37℃，60分鐘。5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡12分鐘，200μl每孔，甩干。6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前34孔有明顯的梯度藍(lán)色，后34孔顯色不明顯，即可終止）。7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底

16、物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。8.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)。注：1.用戶(hù)在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2.每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。3.為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或

17、覆膜。4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于28℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。5.建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，

18、浸泡12分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。計(jì)算計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1.當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量