主要組織相容性復合體I類分子相關(guān)A基因(MICA)抗體與臨床肝移植排斥的相關(guān)性實驗研究.pdf

1、目的：本研究旨在通過對主要組織相容性復合體I 類分子相關(guān)A基因（MICA）的多態(tài)性檢測，探討MICA 抗體在肝移植排斥反應過程中的作用機制。本研究包括：
　　 1）通過對主要組織相容性復合體I 類分子相關(guān)A基因（MICA）轉(zhuǎn)染的細胞系檢測肝移植病人的血清，運用流式細胞儀檢測是否產(chǎn)生針對MICA的抗體來探討MICA 抗體在肝移植免疫排斥反應中的影響機制。
　　 2）運用PCR 方法檢測22例發(fā)生肝移植排斥反應供、受體病人血

2、清中的MICA的等位基因型，確定MICA*008 等位基因在肝移植排斥反應中的作用機制。
　　 3）運用免疫組織化學方法進一步證實MICA 抗原與肝移植排斥反應的關(guān)系。
　　 方法：
　　 課題第一部分：
　　 1）轉(zhuǎn)染MICA的人類B 淋巴母細胞細胞系（721.221）通過細胞培養(yǎng)后，同84例接受肝移植手術(shù)的病人的血清進行流式細胞儀檢測，實驗分為五組，第一組：
　　 MICA 轉(zhuǎn)染細胞（5×10

3、5個）+羊抗鼠抗體2 微升（二抗，熒光抗體）；第二組：MICA轉(zhuǎn)染細胞（5×105個）+抗MICA 抗體（一抗，熒光抗體）+羊抗鼠抗體2 微升（二抗，熒光抗體）；第三組：MICA 轉(zhuǎn)染細胞（5×105個）+AB 血清（陰性對照）+羊抗人（IgG+IgM）10 微升（二抗）；第四組：MICA 轉(zhuǎn)染細胞（5×105個）+陽性對照病人血清+羊抗人（IgG+IgM）10 微升（二抗）；第五組：MICA 轉(zhuǎn)染細胞（5×105個）+抗MICA 抗體

4、（一抗，熒光抗體）+產(chǎn)生排斥反應的病人的血清+羊抗人（IgG+IgM）10 微升（二抗）。各組再用抗MICA 單克隆抗體封閉，以檢測血清中的抗體是否是MICA 特異性抗體。
　　 2）MICA 轉(zhuǎn)染細胞、膽管上皮細胞（BEC）、肝竇內(nèi)皮細胞（LSEC）和肝細胞與5μl的抗MICA 抗體結(jié)合，加入螢光抗體羊抗鼠IgG，分別行流式細胞儀檢測，MICA的未轉(zhuǎn)染細胞和MICA 轉(zhuǎn)染細胞分別作為陰性和陽性對照。
　　 課題第二部分

5、：
　　 1）將22例發(fā)生肝移植排斥反應病人供體、受體的血清分別提取DNA 并以分光光度計進行檢測，采用PCR 方法和標有MICA 等位基因序列的引物進行電泳檢測，分析記錄電泳圖，并與MICA 等位基因圖譜相對照得出各自的MICA 等位基因型。
　　 2）從健康肝臟中分別提取膽管上皮細胞（BEC）、肝竇內(nèi)皮細胞（LSEC）和肝細胞，細胞經(jīng)過培養(yǎng)后，提取RNA 及cDNA 合成, 以葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶（G6PD）被當

6、作內(nèi)生的正常對照，MICA的第一代細胞系和MICA 轉(zhuǎn)染細胞分別作為陰性和陽性對照組，分別行RT-PCR檢測和免疫印記檢測。
　　 課題第三部分：將已經(jīng)病理檢查確診的13例肝移植并發(fā)生排斥反應病人的肝穿刺標本、15例沒有發(fā)生排斥反應的肝移植病人的肝穿刺標本和11例患有結(jié)腸癌病人的結(jié)腸標本行免疫組織化學檢查。其中沒有發(fā)生排斥反應病人的標本設為陽性對照，患有結(jié)腸癌病人的結(jié)腸標本作為陰性對照。
　　 結(jié)果：
　　 1）

7、總共22例（22/84）（26%）術(shù)前或/和術(shù)后病人產(chǎn)生MICA 抗體，其中8例（8/84）（9.5%）為術(shù)前病人，14例（14/84）（17%）為術(shù)后病人，84例病人中，共有43例（43/84）發(fā)生排斥反應，在有MICA 抗體組中，排斥發(fā)生率為63%（14/22），在沒有MICA 抗體組中，排斥發(fā)生率為47%（29/62），二者相比沒有統(tǒng)計學差異。
　　 在非轉(zhuǎn)染細胞組（721.221）沒有發(fā)現(xiàn)MICA 表達，而在轉(zhuǎn)染組提示有

8、高表達; 用抗MICA 單克隆抗體封閉后，血清與MICA 轉(zhuǎn)染的細胞系的結(jié)合被抑制，提示在這些病人血清中檢測到的抗體是MICA 特異性抗體。在MICA 抗體陽性組和陰性組中，無論發(fā)生排斥反應及病人的存活與否，兩組之間都沒有臨床聯(lián)系。
　　 2）流式細胞儀分析顯示，MICA的表達在MICA 轉(zhuǎn)染細胞的表面上；而做為陰性對照，膽管上皮細胞、肝竇內(nèi)皮細胞或肝細胞并沒有發(fā)生任何變化，提示MICA的表達并不在這些細胞表面上。
　　

9、 3）在肝移植供、受體中出現(xiàn)頻率最高的MICA 等位基因是MICA*008，在9例病人供體和受體的抗體當中檢測到了MICA*008，其中，4例病人的供體和受體檢測出MICA*008 完全相配；發(fā)現(xiàn)在4例病人中，供體不匹配的MICA 等位基因是MICA*008；5例病人中，供體不匹配的MICA 等位基因不是MICA*002 就是MICA*010。在14/22（63%）例發(fā)生排斥反應的病人中可以檢測到MICA*008 細胞系抗體，而在29/

10、62（47%）例病人中沒有檢測到MICA*008 細胞系抗體，二者之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　 4）提取的新鮮肝臟細胞和抗MICA 單克隆抗體經(jīng)過免疫印跡法檢測顯示，62kDa 條帶與MICA 多肽的相一致，這一結(jié)果僅見于MICA 轉(zhuǎn)染細胞而不是膽管上皮細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞。
　　 5）在那些發(fā)生排斥反應和沒有發(fā)生排斥反應的肝移植病人標本中僅發(fā)現(xiàn)輕度的MICA 抗原染色，而那些患有結(jié)腸癌并當作陰性對照

11、組的病人，免疫組化顯色后顯示在上皮細胞有很強和散在的細胞質(zhì)染色。
　　 結(jié)論：
　　 1）MICA的表達僅在MICA 轉(zhuǎn)染細胞的表面上，而在膽管上皮細胞、肝竇內(nèi)皮細胞或肝細胞并沒有發(fā)生表達，提示MICA的表達并不在這些細胞表面上。
　　 2）MICA 抗原僅在肝移植病人及發(fā)生排斥反應的肝移植病人的肝組織中發(fā)生微弱的表達，但卻在結(jié)腸癌病人的結(jié)腸上皮組織中發(fā)生強烈表達。
　　 3）統(tǒng)計結(jié)果顯示，在肝移植預留抗