nisin的生產(chǎn)、提純和檢測(cè)

1、Ｎｉｓｉｎ乳酸鏈球菌素Ｎｉｓｉｎ是從乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中提制的一種多肽抗菌素類(lèi)物質(zhì)是一種世界公認(rèn)的安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑。早在1928年Ｒｏｇｅｒｓ和ｗｈｉｔｔｉｅｒ就發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌的代謝產(chǎn)物能夠抑制部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。1944年Ｍａｔｔｉｃｋ和Ｈｉｒｓｃｈ發(fā)現(xiàn)血清學(xué)Ｎ群中的一些乳酸鏈球菌能產(chǎn)生蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)命名為Ｎ＿ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙＳｕｂｓｔａｎｃｅ即Ｎ群抑菌物質(zhì)簡(jiǎn)稱(chēng)為Ｎｉｓｉｎ]。1951年Ｈｉｒｓｃｈ等人應(yīng)用Ｎ

2、ｉｓｉｎ到食品保藏中成功的抑制了由產(chǎn)氣梭狀芽孢桿菌引起的奶酪腐敗極大改善了奶酪的品質(zhì)。1953年由英國(guó)的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了這種新的防腐劑———乳酸鏈球菌素。1969年ＦＡＯＷＨＯ食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)批準(zhǔn)Ｎｉｓｉｎ作為一種生物型防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)。1988年美國(guó)食品和藥物管理局(ＦＤＡ)也正式批準(zhǔn)將Ｎｉｓｉｎ應(yīng)用于食品中。我國(guó)在ＧＢ2760—86中批準(zhǔn)Ｎｉｓｉｎ可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品、肉制品中。迄

3、今為止Ｎｉｓｉｎ已在全世界約60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)被用作防腐劑。1.Ｎｉｓｉｎ的特性1.1分子結(jié)構(gòu)Ｎｉｓｉｎ分子由34個(gè)氨基酸殘基組成分子式為Ｃ143Ｈ228Ｎ42Ｏ37Ｓ7分子量為3510。Ｎｉｓｉｎ分子結(jié)構(gòu)中包含5種稀有氨基酸即ＡＢＡ、ＤＨＡ、ＤＨＢ、ＡＬＡＳＡＬＡ和ＡＬＡＳＡＢＡ它們通過(guò)硫醚鍵形成五個(gè)內(nèi)環(huán)其活性分子常為二聚體或四聚體。二聚體分子量為7000四聚體分子量為14000。經(jīng)過(guò)幾十年的研究人們已發(fā)現(xiàn)Ｎｉｓｉｎ分子有6種類(lèi)型它們

4、分別是Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｚ其中以ＮｉｓｉｎＡ和Ｚ兩種類(lèi)型的研究最為活躍。ＮｉｓｉｎＡ與ＮｉｓｉｎＺ的差異僅在于氨基酸順序上第27位氨基酸的種類(lèi)不同。ＮｉｓｉｎＡ是組氨酸(Ｈｉｓ)而ＮｉｓｉｎＺ是天門(mén)冬酰胺(Ａｓｎ)。資料表明同樣濃度下ＮｉｓｉｎＺ的溶解度和抗菌能力都比ＮｉｓｉｎＡ強(qiáng)。1.2溶解性與穩(wěn)定性Ｎｉｓｉｎ是一種白色易流動(dòng)的粉末使用時(shí)需溶于水或液體中。Ｎｉｓｉｎ的溶解度主要取決于溶液的ｐＨ值在ｐＨ值較低的情況下溶解性較好。其溶解

5、度隨ｐＨ值的降低而升高ｐＨ5.0時(shí)溶解度為4.0%ｐＨ為2.5時(shí)溶解度為12%。Ｎｉｓｉｎ在中性和堿性條件下幾乎不溶解所以在應(yīng)用時(shí)一般先用0.02Ｍ鹽酸溶解再加入到食品中。Ｎｉｓｉｎ的穩(wěn)定性主要取決于溫度ｐＨ值基質(zhì)等因素。Ｎｉｓｉｎ在酸性條件下呈現(xiàn)最大的穩(wěn)定性隨著ｐＨ的升高其穩(wěn)定性大大降低。在ｐＨ為2.0或更低的稀鹽酸中經(jīng)115.6℃高壓滅菌仍能穩(wěn)定存在在ｐＨ為5時(shí)其活力損失40%在ｐＨ為9.8時(shí)其活力損失超過(guò)90%。在一定溫度范圍內(nèi)隨

6、著溫度的升高它的活性喪失增加。當(dāng)Ｎｉｓｉｎ加入到食品中則受到介質(zhì)的保護(hù)一些大分子食物如牛奶肉湯等可使其穩(wěn)定性大大增強(qiáng)。另外Ｎｉｓｉｎ的穩(wěn)定性還與熱處理時(shí)間、食品保藏的溫度及時(shí)間等有關(guān)。1.3抑菌性Ｎｉｓｉｎ主要抑制大部分Ｇ菌特別是細(xì)菌的芽孢。Ｎｉｓｉｎ能抑制葡萄球菌屬、鏈球菌屬、小球菌屬和乳桿菌屬的某些菌種抑制大部分梭菌屬和芽孢桿菌屬的芽孢。例如能有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等引

7、起的食品腐敗。早期的研究認(rèn)為Ｎｉｓｉｎ一般對(duì)霉菌、酵母菌和Ｇ菌是無(wú)效的但近期的研究表明在一定條件下(如冷凍、加熱、降低ｐＨ和ＥＤＴＡ處理)一些Ｇ菌(如沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、假單胞菌等)對(duì)Ｎｉｓｉｎ敏感。Ｎｉｓｉｎ對(duì)Ｇ菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和芽孢有不同的抗菌機(jī)理。Ｎｉｓｉｎ對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗菌機(jī)理有不同的看法。一種觀點(diǎn)認(rèn)為Ｎｉｓｉｎ吸取于細(xì)胞膜上可以抑制細(xì)胞壁中肽聚糖的生物合成使細(xì)胞膜和磷脂化合物的合成受阻導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄引起細(xì)胞裂解[10]。另一觀點(diǎn)認(rèn)

8、為Ｎｉｓｉｎ的抗菌機(jī)理與ＤＨＡ和ＤＨＢ密切相因?yàn)椋危椋螅椋钪械模模龋梁停模龋履軌蚺c敏感菌株細(xì)胞膜中某些酶的巰基發(fā)生作用釋放細(xì)胞質(zhì)造成敏感細(xì)胞裂解。Ｎｉｓｉｎ對(duì)芽孢的作用是在其萌發(fā)前期及膨脹期破壞其膜以抑制其發(fā)芽過(guò)程。1.4安全性Ｎｉｓｉｎ對(duì)蛋白酶特別敏感在消化道中很快被α＿胰凝乳蛋白酶分解。它對(duì)人體基本無(wú)毒性也不與醫(yī)用抗生素產(chǎn)生交叉抗藥性能在腸道中無(wú)害的降解。對(duì)Ｎｉｓｉｎ的毒性、致癌性、存活性、再生性、血液化學(xué)、腎功能、應(yīng)激反應(yīng)以及動(dòng)物

9、器官病毒學(xué)等生物學(xué)研究證明Ｎｉｓｉｎ是安全的。1994年ＦＡＯＷＨＯ規(guī)定其ＡＤＩ為33000ＩＵｋｇＬＤ50為7ｇｋｇ。2Ｎｉｓｉｎ在食品工業(yè)中的應(yīng)用2.1在肉制品中的應(yīng)用傳統(tǒng)的火腿、熏肉和香腸產(chǎn)生中普遍使用亞硝酸鹽、硝酸鹽等發(fā)色劑來(lái)產(chǎn)生典型的腌制紅色和腌制風(fēng)味并抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)但這些添加劑同時(shí)對(duì)人體具有潛在的致癌危險(xiǎn)。Ｎｉｓｉｎ能有效控制肉制品中微生物的生長(zhǎng)尤其是抑制產(chǎn)生毒素的肉毒梭狀芽孢桿菌的活性并且Ｎｉｓｉｎ本身呈酸性能

10、降低周?chē)橘|(zhì)的ｐＨ值因而能降低殘留的亞硝酸鹽的含量減少亞硝胺的形成。Ｒａｙｍａｎ等(1981)提出Ｎｉｓｉｎ可作為一種有效的替代物減少火腿中發(fā)色劑的用量。另外在加工過(guò)程中過(guò)分的熱處理會(huì)明顯改變?nèi)庵破返馁|(zhì)地及外觀加入Ｎｉｓｉｎ后僅需45%的熱處理即可延長(zhǎng)其貯存期。孫保華等(1997)將Ｎｉｓｉｎ添加于紅腸中可顯著降低細(xì)菌總數(shù)并延長(zhǎng)產(chǎn)品保存期。袁秋萍(1998)研究表明在香腸中Ｎｉｓｉｎ添加量為0.3ｇｋｇ絕大多數(shù)的革蘭氏陽(yáng)性菌受到抑制而且

11、產(chǎn)品色、香、味不受影響豬肉絲中添加0.48ｇｋｇＮｉｓｉｎ可取代山梨酸鉀作防腐劑并能提高產(chǎn)品質(zhì)量。羅欣等將Ｎｉｓｉｎ首次用于牛肉冷卻肉的保鮮。還連棟(2000)等將Ｎｉｓｉｎ用于扒雞的生產(chǎn)。研究表明添加Ｎｉｓｉｎ可降低殺菌溫度保質(zhì)期達(dá)半年以上并且使扒雞的口感得到改善。2.2在乳制品中的應(yīng)用乳制品營(yíng)養(yǎng)豐富極易腐敗變質(zhì)經(jīng)巴氏滅菌和冷藏可延長(zhǎng)保存期但其中肉毒梭狀芽孢桿菌仍能存活并產(chǎn)生一定毒素。Ｎｉｓｉｎ可用于巴氏滅菌牛奶添加量為30～50ｍｇ

12、ｋｇ通常在35℃下產(chǎn)品貨架期可延長(zhǎng)一倍罐裝煉乳中添加80～100ｍｇｋｇ的Ｎｉｓｉｎ能減少10ｍｉｎ滅菌時(shí)間ＵＨＴ奶中添加20ｍｇｋｇ的Ｎｉｓｉｎ能完全抑制滅菌乳中嗜熱細(xì)菌芽孢的生長(zhǎng)。郭清泉等實(shí)驗(yàn)證明添加40ＩＵｍｌ的Ｎｉｓｉｎ于酸奶中將酸奶的后酸化推遲了3天且菌數(shù)保持在107個(gè)ｍｌ以上而且感官質(zhì)量良好。2.3在罐頭制品中的應(yīng)用Ｎｉｓｉｎ在酸性條件下易溶、穩(wěn)定、抑菌活力也高因此可用于高酸性(ｐＨ4.6)罐頭的保鮮。如西紅柿罐頭中添加Ｎｉ

13、ｓｉｎ可防止因耐酸的Ｇ菌群如巴氏梭菌、浸淋芽孢桿菌引起的腐敗添加量一般為100～200ＩＵｇ。在低酸性(ｐＨ4.6)罐頭如馬鈴薯、蘑菇、水果罐頭中即使經(jīng)高熱處理仍有一些嗜熱菌的芽孢幸存以致引起罐頭的腐敗并且高熱處理對(duì)食品的感官質(zhì)量有一定影響。添加適量的Ｎｉｓｉｎ不僅可以有效地抑制芽孢的生長(zhǎng)還可減少罐頭的熱處理時(shí)間保持其新鮮度并延長(zhǎng)保存期。錢(qián)平等采用沸水殺菌和添加Ｎｉｓｉｎ相結(jié)合的方法對(duì)蔬菜罐頭進(jìn)行殺菌結(jié)果表明經(jīng)過(guò)處理的罐頭感官特性大為改

14、善且在室溫下貯藏期達(dá)到兩年。2.4在醬菜中的應(yīng)用瓶裝醬菜是可供長(zhǎng)期貯存的方便食品。瓶裝醬菜一般采用巴氏滅菌殘存的細(xì)菌主要為梭狀芽孢菌及少數(shù)耐熱的Ｇ菌。傳統(tǒng)的抑制雜菌的方法主要依賴(lài)于產(chǎn)品的高滲透壓(高鹽、高糖)、低氧環(huán)境及添加化學(xué)防腐劑。目前各類(lèi)醬菜中含鹽量偏高約在10～20%之間但高鹽食品易誘發(fā)高血壓等疾病。加入100ｍｇｋｇＮｉｓｉｎ可抑制雜菌生長(zhǎng)并使鹽的濃度下降為7～9%。由于一些國(guó)家在食品中不準(zhǔn)使用苯甲酸鈉所以Ｎｉｓｉｎ用于瓶裝醬

15、菜出口具有現(xiàn)實(shí)意義。2.5在酒精飲料中的應(yīng)用腐敗乳酸菌對(duì)Ｎｉｓｉｎ敏感但酵母幾乎不受其影響。因此Ｎｉｓｉｎ可與酵母一起在生產(chǎn)啤酒、果酒、烈性乙醇等酒精飲料時(shí)加入用來(lái)抑制Ｇ菌。啤酒生產(chǎn)中易受乳桿菌和啤酒片球菌的污染發(fā)生混濁、變酸、發(fā)粘等現(xiàn)象。Ｏｇｄｅｎ等(1985)用平板打孔法檢測(cè)得出啤酒常見(jiàn)腐敗菌幾乎均能被100ＩＵｍｌＮｉｓｉｎ所抑制。添加Ｎｉｓｉｎ的啤酒可以降低巴氏滅菌的時(shí)間和溫度并能延長(zhǎng)啤酒尤其是非巴氏滅菌和瓶裝啤酒的貨架期。Ｏｇ

16、ｄｅｎ等(1988)對(duì)照不加Ｎｉｓｉｎ的啤酒存放期延長(zhǎng)了一倍的時(shí)間。Ｒａｄｌｅｒ(1981)曾把Ｎｉｓｉｎ應(yīng)用于白酒釀造中有效地阻礙了腸膜狀明串珠菌啤酒片球菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)防止了雜菌的污染。2.6其它Ｎｉｓｉｎ也可用于焙烤食品中以防止蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)。Ｊｅｎｓｏｎ等人用Ｎｉｓｉｎ作防腐劑在制作烤餅的面團(tuán)中添加不同濃度的Ｎｉｓｉｎ作試驗(yàn)結(jié)果顯示:Ｎｉｓｉｎ添加量為6.25μｇｇ即可有效地抑制蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)。Ｎｉｓｉｎ還可用于對(duì)Ｎｉｓ