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文檔簡介
1、多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)作為一種重要的防火材料,被廣泛應(yīng)用于電器、電線、家具、紡織品等產(chǎn)品中。PBDEs和多氯聯(lián)苯(Polychlorinatedbiphenyls,PCBs)同屬于鹵代烴類化合物,根據(jù)苯環(huán)上溴原子和氯原子數(shù)目和位置的不同,PBDEs和PCBs 在理論上均含有10 大類209種同系物。雖然目前兩者的生產(chǎn)和使用均受到了限制,尤其是PCBs 在很多國家被禁止生產(chǎn)和
2、使用,但在地球生物圈的任何地方,如空氣、水、土壤、各種沉淀物以及野生動物、魚類、家禽和人類的機體組織中都有PBDEs和PCBs 存在,其中PBDEs檢出值呈逐年上升趨勢。
由于PBDEs和PCBs 具有結(jié)構(gòu)的相似性,因此PBDEs和PCBs 具有相似的毒性作用。目前大量的體外、體內(nèi)研究結(jié)果表明,PBDEs和PCBs作用的靶器官主要是脂肪組織、甲狀腺、生殖發(fā)育及中樞神經(jīng)系統(tǒng),兩者均具有多種毒性,如神經(jīng)毒性、生殖毒性、免疫毒性
3、、肝毒性和致癌性,作為一種內(nèi)分泌干擾物,具有類雌激素活性,可引起甲狀腺的增生,導(dǎo)致甲狀腺素代謝的改變。
多項動物實驗研究結(jié)果表明,在鼠大腦發(fā)育的關(guān)鍵期,暴露于低劑量的PBDEs可導(dǎo)致成年鼠腦功能異常,主要表現(xiàn)為自主行為紊亂,學(xué)習(xí)記憶缺損等,且隨年齡的增長越來越嚴(yán)重。因此,近年來PBDEs的發(fā)育神經(jīng)毒性作用越來越受到人們的關(guān)注。
然而,PBDEs 神經(jīng)毒性的研究工作仍處于起步階段,目前研究也多集中于神經(jīng)行為、認(rèn)
4、知功能、學(xué)習(xí)與記憶等神經(jīng)毒效應(yīng)方面,而對PBDEs 如何引起這些神經(jīng)毒效應(yīng)的機制研究較少涉及,因此,針對PBDEs的神經(jīng)毒性作用機制展開研究,將有利于尋找PBDEs 神經(jīng)毒性作用的靶點,為PBDEs的神經(jīng)毒性作用的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。
Madia等在體外實驗研究中發(fā)現(xiàn)PBDE-99和Aroclor1254 均可誘導(dǎo)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。本研究前期體外實驗結(jié)果也表明PBDEs 同系物PBD
5、E-47可誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。大量研究均已證明在多細(xì)胞生物的基本生命活動中,細(xì)胞凋亡起著十分重要的作用,許多外源化合物的毒性作用與細(xì)胞凋亡有關(guān)。目前已知的三個主要的凋亡信號通路是:1)線粒體通路;2)死亡受體通路;3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。所有這些信號通路都能激活凋亡執(zhí)行者Caspase3,通過水解各種各樣的細(xì)胞成分而使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡在PBDEs所致神經(jīng)毒性中的作用,目前尚未見研究報道。
Hites等綜合分
6、析了全球已公布的人群監(jiān)測結(jié)果,認(rèn)為與人群關(guān)系最密切的5種PBDEs 同系物是PBDE-47(2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether,PBDE-47)、99、100、153、154。而Bi等對中國南方某城市2l對嬰兒臍帶和母親靜脈血樣的分析結(jié)果顯示,PBDE-47和PBDE-153是PBDEs 最主要的同系物。2,2',4,4',5,5'-六氯聯(lián)苯(2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphe
7、nyl,PCB153)是人體組織和人乳中含量最多的PCBs 同系物之一,因此,PCB153是PCBs中與人類健康關(guān)系密切的同系物之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCB153和PBDE-47可同時存在于環(huán)境和人體組織中,但目前尚未見兩者聯(lián)合毒作用及其機制的研究報道。
基于上述理由,PBDE-47和/或PCB153是否通過三條經(jīng)典凋亡信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,進而引發(fā)一系列神經(jīng)毒效應(yīng)呢,這正是本研究立題的目的所在。本研究采用體外和體內(nèi)實
8、驗,利用四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法、分光光度法、Morris 水迷宮實驗、超微病理檢測、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)、適時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime fluorescent quantitation reverse transcriptase polymerase chain
9、reaction,real timeRT-PCR)和Western blot等技術(shù)和方法,通過檢測神經(jīng)細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)漏出、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(intracellular free Ca2+concentration,[Ca2+]I)、大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力、大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及神經(jīng)細(xì)胞X 染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X-chromosome-linked inhibitor
10、of apoptosis protein,XIAP)、含半胱氨酸的天冬氨酸酶12(cysteine containing aspartate specific protease 12,Caspase12)、含半胱氨酸的天冬氨酸酶3(cysteine containing aspartate specific protease 3,Caspase3)、死亡相關(guān)蛋白激酶(death associated protein kinase,DAP
11、K)和細(xì)胞色素C(CytochromeC)等凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達,研究PBDE-47和/或PCB153的神經(jīng)毒性作用及其可能的毒作用機制。
第一部分:PBDE-47和/或PCB153對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用及其機制研究
目的:由于PBDE-47與PCB153 分別作為PBDEs和PCBs的同系物可共存于環(huán)境和人組織中,因此本研究旨在探查PBDE-47的神經(jīng)毒效應(yīng)及其機制,同時研究PBDE-
12、47與PCB153 共同存在時對神經(jīng)細(xì)胞的聯(lián)合毒作用方式。
方法:SH-SY5Y細(xì)胞被暴露于PBDE-47(0、1、5和10 μmol/L)和/或PCB153(0和5 μmol/L)24h后,使用MTT法、分光光度法、流式細(xì)胞術(shù)、real time RT-PCR技術(shù)和Western blot 技術(shù)分別檢測了細(xì)胞存活率、LDH 漏出、[Ca2+]I、細(xì)胞凋亡百分率及DAPK、XIAP、Caspase12、Caspase3 以
13、及Cytochrome C等凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。
結(jié)果:和對照組比較,一定劑量的PBDE-47可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05),LDH 漏出、[Ca2+]I和凋亡率明顯上升(P<0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn),DAPK和Capspase3 mRNA,Caspase12和Cytochrome C mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均顯著性增加(P<0.05),而Pro-caspase3 蛋白質(zhì)表達水
14、平是明顯下降的(P<0.05)。
相關(guān)分析表明,[Ca2+]I與細(xì)胞凋亡率間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.86,P<0.05)。析因分析表明,在誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降、[Ca2+]I增加、凋亡和LDH 漏出,以及誘導(dǎo)XIAP、Caspase3和Cytochrome C mRNA表達,和XIAP、Pro-caspase3、Caspase12和Cytochrome C 蛋白質(zhì)表達方面,PBDE-47與PCB153之間存在交
15、互作用。
結(jié)論:PBDE-47 具有明顯的SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用。三條經(jīng)典凋亡途徑均可能參與了PBDE-47誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡,且胞內(nèi)鈣平衡失調(diào)可能是其主要誘導(dǎo)因素之一。一定劑量的PBDE-47與PCB153 共同作用于SH-SY5Y細(xì)胞時其毒效應(yīng)增加。
第二部分:PBDE-47和/或PCB153對SD大鼠發(fā)育神經(jīng)毒作用及其機制研究
目的:由于PBDE-47與PCB153可在環(huán)境和
16、生物組織中共存,因此本研究旨在探討PBDE-47與PCB153單獨和聯(lián)合對SD大鼠的發(fā)育神經(jīng)毒作用及其機制。
方法:在SD大鼠出生第10天,通過灌胃一次性暴露于PBDE-47(0、1、5和10 mg/kg)和/或PCB153(0和5 mg/kg),在大鼠出生后2個月時通過Morris 水迷宮實驗、超微病理檢測、化學(xué)發(fā)光免疫定量分析技術(shù)、real time RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶
17、能力、海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)、甲狀腺激素水平和XIAP、DAPK、Caspase3、Caspase12 及Cytochrome C等凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。
結(jié)論:PBDE-47 具有明顯的發(fā)育神經(jīng)毒性作用。三條經(jīng)典凋亡途徑均可能參與了PBDE-47誘導(dǎo)的發(fā)育神經(jīng)毒性作用。影響甲狀腺發(fā)育和降低甲狀腺激素分泌可能是其具有發(fā)育神經(jīng)毒性作用的原因之一。在發(fā)育的關(guān)鍵期,一定劑量的PBDE-47與PCB153共同
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