TR注射液長(zhǎng)期毒性評(píng)價(jià)和神經(jīng)毒性機(jī)制研究.pdf

1、第一部分TR長(zhǎng)期毒性研究
　　目的：觀察TR 注射液連續(xù)給藥大鼠和Beagle 犬后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度、主要毒性靶器官及損害的可逆性，找到無毒性反應(yīng)劑量，為臨床設(shè)計(jì)人用劑量和主要觀察指標(biāo)提供參考。
　　 方法：健康SD大鼠80只按體重隨機(jī)分為02550100mg/kg 四個(gè)劑量組，每組20只，雌雄各半，腹腔注射；健康Beagle 犬26只按體重分為051545 mg/kg 四個(gè)劑量組，其中0515 mg/k

2、g組每組6只動(dòng)物、45mg/kg組8只動(dòng)物，雌雄各半，靜脈注射給藥。每周周一至周六給藥，連續(xù)給藥90天，恢復(fù)期為30天。在給藥后1小時(shí)內(nèi)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的一般癥狀及相關(guān)指標(biāo)如食量、體重、呼吸、肛溫、瞳孔等。大鼠在給藥后第90天（d90, 停藥期）和第120天（d120,恢復(fù)期）每組各1/2大鼠采血測(cè)定各組動(dòng)物的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白定量、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白容量、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞

3、、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、大未染色細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間及血漿纖維蛋白原等血液學(xué)指標(biāo)以及測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、總膽紅素、尿素氮、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽固醇、甘油三脂、肌酸磷酸激酶，血清鈣、磷、血清鉀、鈉和氯等血液生化指標(biāo)。犬在給藥前、給藥后第45天、第90天和第120天檢測(cè)心率、P 波電壓、P-R間期、R 波電

4、壓、QRS時(shí)間、ST 段、T 波電壓和QT 間期等心電圖指標(biāo)；紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白定量、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白容量、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分 類、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、大未染色細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間及血漿纖維蛋白原等血液學(xué)指標(biāo)；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、總膽紅

5、素、尿素氮、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽固醇、甘油三脂、肌酸磷酸激酶，血清鈣、磷、血清鉀、鈉和氯等血液生化指標(biāo)；測(cè)試尿液葡萄糖、蛋白質(zhì)、膽紅素、尿膽原、pH比重、紅細(xì)胞、酮體、亞硝酸鹽和白細(xì)胞等尿液指標(biāo)。在給藥后第90天和第120天分別對(duì)每組各1/2的動(dòng)物剖檢，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查及骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)分類。
　　 結(jié)果：1. TR 注射液25～ 100mg/kg 連續(xù)ip大鼠90天毒性試驗(yàn)：(1)100mg/kg 劑量時(shí)對(duì)雌性大鼠體

6、重增長(zhǎng)有輕微影響。(2)對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)未見明顯影響。(3) 100mg/kg劑量時(shí)可使雌性大鼠d90的肌酐明顯升高。(4)對(duì)骨髓系統(tǒng)無明顯毒性作用。(5)對(duì)大鼠主要臟器的絕對(duì)重量和相對(duì)重量無明顯影響。未觀察到藥物對(duì)心、肝、腎、肺、腦等實(shí)質(zhì)器官有顯著的毒性作用。(6)對(duì)給藥部位無局部刺激作用。2. TR 注射液5～ 45mg/kg iv Beagle 犬90天毒性試驗(yàn)：(1)劑量達(dá)45 mg/kg時(shí)，給藥期間動(dòng)物四肢僵直、站立不穩(wěn)、側(cè)臥

7、、流涎、嘔吐（胃內(nèi)容物）、排便、部分動(dòng)物嚎叫、角弓反張（2只），逐漸安靜，1h右均可恢復(fù)。提示TR對(duì)動(dòng)物消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)有毒副作用，但作用可逆。藥物對(duì)Beagle 犬體重、肛溫、呼吸和瞳孔無明顯影響。(2)對(duì)ECG 無明顯影響。(3)對(duì)血液學(xué)指標(biāo)無明顯影響。(4)對(duì)血液生化指標(biāo)無明顯影響。(5)對(duì)尿液指標(biāo)無影響。(6)對(duì)骨髓系統(tǒng)無明顯毒性作用。(7)病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)Beagle 犬有明顯毒性損傷的形態(tài)學(xué)證據(jù)，無明顯血

8、管和肌肉刺激性。
　　 結(jié)論：（1TR注射液25～ 100mg/kg 連續(xù)ip大鼠90天，安全劑量為50mg/kg 毒性劑量為100mg/kg 毒性靶器官為消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)(臟)但毒性作用均為功能性的且可逆；（2 TR 注射液5～ 45 mg/kg iv Beagle 犬90天，中毒劑量為15 mg/kg, 嚴(yán)重中毒劑量為45 mg/kg, 毒性靶部分為消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，但毒性作用均為功能性的且作用可逆。

9、　　 第二部分TR神經(jīng)毒性機(jī)制研究
　　 目的：結(jié)合TR 注射液90天Beagle 犬長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)進(jìn)行，對(duì)Beagle 犬中腦組織進(jìn)行全基因組變化研究，找到TR 神經(jīng)毒性反應(yīng)的可能機(jī)制。
　　 方法：取8只受試犬的中腦組織（停藥期0mg/kg 劑量組3只，停藥期45 mg/kg 劑量組4只，恢復(fù)期45 mg/kg劑量組1只），提取細(xì)胞中的RNA 標(biāo)記并擴(kuò)增后與基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)掃描分析篩選出表達(dá)差異的基因，對(duì)部

10、分有表達(dá)差異的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR, RT-PCR基因驗(yàn)證和免疫印跡法（Western Blot, WB蛋白驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：（1芯片雜交信號(hào)清晰，背景低，信噪比高。（2 經(jīng)過T-test 檢驗(yàn)，篩選出顯著上調(diào)（信號(hào)比值≥2 或顯著下調(diào)（信號(hào)比值≦0.5的差異表達(dá)基因2085個(gè)。（3按照基因功能分類體系（Gene Ontology, GO分析差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示，與生物學(xué)過程相關(guān)的差異基因共11

11、0個(gè)，共分16 類，如正向調(diào)節(jié)細(xì)胞通訊、調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)程、調(diào)節(jié)多細(xì)胞生物過程、調(diào)節(jié)DNA代謝過程、調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)氨基酸的磷酸化，反向調(diào)節(jié)生物學(xué)過程等。（4 導(dǎo)致藥物神經(jīng)毒性的可能信號(hào)通路有：細(xì)胞粘附分子信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號(hào)通路、白細(xì)胞穿透內(nèi)皮遷移信號(hào)通路、粘著斑信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、甘氨酸/氨酸/氨酸代謝信號(hào)通路。（5基因芯片雜交發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)/調(diào)的基因，用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)也得到同樣的結(jié)果，說明在基因芯片上發(fā)

12、生改變的基因能夠被RT-PCR 驗(yàn)證出來。（6 TR 處理組中的LAMC2蛋白的表達(dá)水平比溶媒對(duì)照組明顯提高，NRXN1蛋白的表達(dá)水平比溶媒對(duì)照組明顯降低，與基因芯片結(jié)果吻合。
　　 結(jié)論：（1基因芯片檢測(cè)和聚類分析結(jié)果有效；（2TR的中樞神經(jīng)毒性作用可能和其以下作用有關(guān)：通過調(diào)控細(xì)胞粘附分子信號(hào)通路中的NXRN1等基因?qū)е螺S突蛋白的表達(dá)量減少，影響神經(jīng)元之間的突觸傳遞和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)通路中的LAMC2等基因，