琥珀酰明膠注射液減輕cRGD-siRNA所致小鼠腎毒性的實驗研究.pdf

1、背景：
　　siRNA通過抑制靶mRNA轉錄而引起特異性基因沉默，它已經(jīng)成為治療基因過表達引起的疾病的新型治療策略。但是，siRNA在臨床應用前還遇到了很多障礙，包括靶向性差、細胞攝取率低等，通過將siRNA整合到各種靶向性配體中可解決以上問題。
　　整合素是細胞粘附分子的一種，是連接細胞核與外環(huán)境的跨膜受體。其中，整合素αvβ3受體在腫瘤血管中有很高表達，但是在正常內(nèi)皮細胞中幾乎不表達。環(huán)狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cR

2、GD)是一種整合素配體，可被αvβ3受體特異性識別。利用這一特點，以cRGD為載體，合成介導siRNA聚集在腫瘤的新型腫瘤靶向藥物。
　　然而，發(fā)現(xiàn)cRGD-siRNA分子系統(tǒng)給藥會引發(fā)腎毒性，必須找到可以有效防治cRGD-siRNA腎毒性的藥物。琥珀酰明膠注射液，即佳樂施，是低血容量時的膠體血漿代用品，研究表明，佳樂施可以將RAFT-RGD的重吸收明顯降低。
　　目的：
　　本實驗將佳樂施和cRGD-siRNA經(jīng)過尾

3、靜脈混合注射到小鼠體內(nèi)，進行血液分析、病理切片、TUNEL分析等試驗，驗證佳樂施對cRGD-siRNA分子導致的腎毒性的減輕作用，為今后cRGD-siRNA的臨床治療掃除障礙、提供支持。
　　方法：
　　1.cRGD-siRNA分子的制備和鑒定
　　將環(huán)狀cRGD肽通過巰基與siRNA分子正義鏈的5'端共軛連接，得到cRGD-siRNA分子，用HPLC和質(zhì)譜測定得到的cRGD-siRNA分子的純度和結構。
　　2

4、.實驗動物分組和血清生化指標測定
　　將成年雄性昆明小鼠隨機分成以下三組，每組6只:1）cRGD-siRNA組:尾靜脈注射cRGD-siRNA(5nmol);2)cRGD-siRNA和佳樂施混合注射組:尾靜脈注射cRGD-siRNA(5nmol)和佳樂施(4mg)混合液;3）對照組:尾靜脈注射生理鹽水(100μl)。每隔48h給藥一次，共5次，最后一次給藥兩天后，取血分離血清，測定每組血清肌酐和尿素氮的含量。
　　3.組織學

5、觀察和TUNEL染色
　　處死小鼠，取出腎臟，進行常規(guī)HE染色并觀察。切片脫蠟后用蛋白酶k溶液孵育，然后用含有FITC-12-dUTP標記混合物的TdT孵育緩沖液孵育，在DAPI中染色，熒光顯微鏡下觀察并計算TUNEL凋亡指數(shù)。
　　結果：
　　1.cRGD-siRNA分子的制備和鑒定
　　本課題成功制備了如下siRNA序列:sense strand:5'-(mG)(mA)(mG)AACCUCACAUGGU(mA

6、)(mC)(mA)dTdT-3';antisense strand:5'-(mU)(mG)(mU)ACCAUGUGAGGUU(mC)(mU)(mC)dTdT-3'。HPLC測定cRGD-siRNA分子的純度可達81％，質(zhì)譜測定其分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量一致。
　　2.血清生化指標測定
　　cRGD-siRNA組血清尿素氮和肌酐含量比對照組明顯升高，而佳樂施共同給藥組血清尿素氮和肌酐明顯比cRGD-siRNA組低(P＜0.05)

7、。
　　3.組織學觀察和TUNEL染色
　　HE染色結果顯示cRGD-siRNA組大量腎小管上皮細胞水腫、壞死，紅細胞滲出，部分腎小球萎縮，而佳樂施混合注射組腎損傷明顯減輕。TUNEL結果表明，佳樂施混合注射組凋亡細胞較少，cRGD-siRNA組凋亡細胞明顯增多，兩組的細胞凋亡指數(shù)有顯著差異(P＜0.05)。
　　結論：
　　成功合成了cRGD-siRNA分子并證實了佳樂施可明顯減輕cRGD-siRNA導致的腎損