雙酶切及連接

1、5組：李東 老師：陳思,雙酶切及連接,目錄,原理類型命名法實驗注意事項連接常見問題及對策,DNA的限制性酶切實驗原理,核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。,根據(jù)限制酶的識別切割特性，

2、 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。,限制性內(nèi)切酶的類型,限制性內(nèi)切酶的類型,第一類（I型）限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。,第二類（III型）限制性內(nèi)切酶：也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位

3、置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。,限制性內(nèi)切酶的類型,第三類（Ⅱ型）限制性內(nèi)切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性內(nèi)切酶. 它們能識別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為４～６個堿基對的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序； Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)

4、生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行改造，從而極大地推動了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。,限制性內(nèi)切酶的類型,粘性末端：是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’在雙鏈上交錯切割的

5、位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’各有一個單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’3’…… CTA|TAG …… 5’ 　切割后形成5’…… GAT A

6、TC …… 3’3’…… CTA TAG …… 5’ 這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。,平頭末端：,用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用Eco表示，所以用斜體字。用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如HindⅠ, HindⅡ，Hi

7、ndⅢ等。,限制性核酸內(nèi)切酶的命名法,實驗材料及儀器,高速離心機(jī)，電爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍頭，Ep管，手套，記號筆，TAE電泳緩沖液(10×)，瓊脂糖，溴化乙錠(EB)，質(zhì)粒DNA,雙酶切,按如下體系加入到0.5ml離心管中,加體系離心37℃ 水浴1h跑電泳,結(jié)果,,結(jié)果與分析,質(zhì)粒的雙酶切沒有出現(xiàn)結(jié)果但marker出了條帶說明膠沒有問題，而PCR的酶切產(chǎn)物出現(xiàn)了較好的實驗結(jié)果。,

8、１．內(nèi)切酶：不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染； 注意內(nèi)切酶的識別位點及形成的粘性末端；內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶單位和ＤＮＡ用量而定。同時內(nèi)切酶體積不能超過反應(yīng)體系１０％，因內(nèi)切酶中含５０％甘油，體系中甘油超過５％會抑制內(nèi)切酶活力； 內(nèi)切酶操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行（冰上）；使用時防止操作中對內(nèi)切酶的污染。,五、注意事項——限制性內(nèi)切酶酶切,連接反應(yīng),DNA 分子的體外連接（重組）是指外源 DNA 片段和載體 DNA 分

9、子在體外通過 DNA 連接酶共價連接。 DNA酶切片段的聯(lián)接是兩DNA片段相鄰的 5'磷酸和3'羥基間可由聯(lián)接酶催化形成磷酸二酯鍵，即能完成聯(lián)接反應(yīng)。,連接體系,,,內(nèi)切酶失活DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子條件不適（試劑、溫度）DNA酶切位點上的堿基被甲基化DNA酶切位點上沒有甲基化（如Dpn I）DNA位點上存在其它修飾DNA不存在該酶識別順序,標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性將DNA過

10、柱純化，乙醇沉淀DNA檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細(xì)菌菌株換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增將DNA底物與λDAN混勻進(jìn)行切割驗證換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗證,六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,問題一：DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割,原 因

11、,對策,,內(nèi)切酶活性下降內(nèi)切酶稀釋不正確DNA不純，反應(yīng)條件不佳內(nèi)切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾部分DNA溶液粘在管壁上內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)酶切后DNA粘末端退火由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性過度稀釋使酶活性降低反應(yīng)條件不適識別位點兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序,用5-10倍量過量消化用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶同上同上反應(yīng)前離心數(shù)秒將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積電泳