β-淀粉酶-海藻糖合酶雙功能融合酶表達、分離純化及酶學(xué)特性的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、海藻糖,新型非還原性二糖,具有優(yōu)良的保護特性。可在高熱環(huán)境下保護食品、化妝品和藥物,穩(wěn)定其中含有的蛋白的結(jié)構(gòu)不變性,因此,使得海藻糖的商品化前景潛力巨大。
  海藻糖的生產(chǎn)工藝復(fù)雜,導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高,阻礙了海藻糖的應(yīng)用。本研究以融合了β-淀粉酶基因和海藻糖合酶基因的雙功能融合酶蛋白為基礎(chǔ),通過分離純化手段去除雜蛋白,分析融合酶的酶學(xué)特性,通過優(yōu)化剛性連接肽長度獲得比較穩(wěn)定、高效的雙功能融合酶。
  本研究首先在M9培養(yǎng)基的基

2、礎(chǔ)上,采用單因素結(jié)合正交法優(yōu)化培養(yǎng)基,并命名為M9-MZ,并對誘導(dǎo)表達條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后融合酶BT3在pH7.0、45℃下以6%的直鏈淀粉為底物催化反應(yīng)6 h后,海藻糖的濃度最高為18.52 g/L,海藻糖轉(zhuǎn)化率為30.87%,粗酶液的酶活力為13.6 U/mL。與M9-ZJ-LM培養(yǎng)基得到的結(jié)果相比,融合酶酶活力提高了28.5%。
  本研究根據(jù)融合酶的6×His-tag標(biāo)簽,首先采用Ni-NTA親和層析進一步結(jié)合陰離子交換

3、層析得到純?nèi)诤厦?,最終的純化倍數(shù)為12.97,酶活力回收率為25.37%。經(jīng)過測定酶學(xué)性質(zhì):最適反應(yīng)溫度為40℃;最適pH8.0,向堿性方向偏移了0.5個單位;熱穩(wěn)定性比單酶高,耐堿能力也高于單酶;3 mmol/L金屬離子Ba2+、Co2+、Cu2+存在下三種酶的活力明顯受到抑制,Mg2+對酶活力有促進作用。經(jīng)過 HPLC測定,融合酶BT3的酶活力為92.4 U。催化6%直鏈淀粉溶液,純化后的融合酶BT3轉(zhuǎn)化海藻糖濃度為33.72g/L

4、,產(chǎn)率為56.2%,比純化前(18.52g/L,30.9%)提高了26.7%,融合酶BT3的海藻糖產(chǎn)率與混合酶系相比提高了6%。
  本研究通過替換不同長度的剛性連接肽(EAAAK)n,n=2-4,重新得到了三種融合酶BT3-A,BT3-B,BT3-C。通過比較純化后三種融合酶催化6%直鏈淀粉溶液,海藻糖濃度分別為:30.36 g/L、32.29 g/L和37.99 g/L。其中,BT3-C催化得到的海藻糖濃度高,海藻糖產(chǎn)率達到6

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