麥清蛋白的初步提取

1、實(shí)驗(yàn)四預(yù)習(xí)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)四預(yù)習(xí)報(bào)告：麥清蛋白的初步提取麥清蛋白的初步提取1.1.研究背景研究背景生物大分子的分離純化是科學(xué)研究和商業(yè)化開(kāi)發(fā)所需要的。而對(duì)某一特定目標(biāo)物的制備是基于其自身獨(dú)特的性質(zhì)。但隨著純度要求的提高，同一類物質(zhì)之間的性質(zhì)的相似使進(jìn)一步的精分離難度也隨之提高。理論研究對(duì)物質(zhì)濃度的要求，在原有技術(shù)難以達(dá)到的情況下，必然催生新的技術(shù)以提高純化水平。由此產(chǎn)生了許多的分離純化技術(shù)。在所有的分離純化技術(shù)中，層析技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)始終占

2、據(jù)著生物大分子純化的主導(dǎo)地位。層析法是利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以固定相對(duì)流動(dòng)相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。根據(jù)物質(zhì)的分離機(jī)制，又可以分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類別。層析法具有明顯的優(yōu)勢(shì)：（1）從理論上來(lái)講，只要遷移距離足夠長(zhǎng)，任何物質(zhì)都可以從其所在的混合體系中被分離出來(lái)；（2）除了定性能力較差以外，層析法幾乎囊括了物質(zhì)分析純化中的所有優(yōu)

3、點(diǎn)，比如分離效率高、速度快，樣品用量少、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、易于自動(dòng)化管理等；（3）基于不同的原理，層析法衍生出諸多的操作技術(shù)，在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)待分離物質(zhì)的特定性質(zhì)選擇適合的操作技術(shù)?；谝陨显?，層析法在分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用，在分離高純度、高活性的生物大分子中有著不可替代的作用。2.2.研究目標(biāo)研究目標(biāo)以凝膠過(guò)濾層析法完成麥清蛋白的脫鹽以驗(yàn)證該技術(shù)的可行性；掌握柱層析技術(shù)的基本操作技巧；體會(huì)相

4、關(guān)技術(shù)的發(fā)明思路和歷程，領(lǐng)悟新技術(shù)的發(fā)明對(duì)邊緣性實(shí)驗(yàn)學(xué)科的重要作用。3.3.研究策略研究策略本實(shí)驗(yàn)選取廣泛用于生物大分子純化的分子篩層析技術(shù)完成麥清蛋白的除鹽從而來(lái)研究層析技術(shù)。通過(guò)鹽析法對(duì)小麥種子提取液做初步的提純，得到麥清蛋白與硫酸銨的混合物，然后通過(guò)凝膠過(guò)濾層析除鹽，最后利用紫外分光光度法測(cè)定各階段純化產(chǎn)物的OD280以檢測(cè)蛋白含量，同時(shí)用BaCl2檢測(cè)純化產(chǎn)物中有無(wú)硫酸根離子從而鑒定純化效果。稱取適量葡聚糖凝膠G25→加入足量蒸

5、餾水或洗脫液→沸水浴溶脹5h→攪拌使其懸浮→靜置，使大部分凝膠沉降→用傾斜法除去含細(xì)碎顆粒的上層液→反復(fù)多次，直至無(wú)細(xì)顆粒為止→將凝膠在真空干燥器中減壓除氣，準(zhǔn)備裝柱（2）裝柱層析柱下端止水→裝入約14柱長(zhǎng)的洗脫液→倒入凝膠，開(kāi)啟洗脫→裝柱至34左右，注意使柱中凝膠一直處在溶液中（注：裝柱完成后層析柱下端需適時(shí)止水以保證洗脫液面高于凝膠頁(yè)面3～5cm，以防凝膠因脫水而毀柱）→凝膠沉降完成，旋上柱帽并連接洗脫系統(tǒng)，平衡洗脫3h（注：裝柱時(shí)

6、應(yīng)保證層析柱的均一性，否則會(huì)嚴(yán)重影響分離的結(jié)果。合格的凝膠柱應(yīng)該上下均一，無(wú)界面、氣泡和裂隙）→連接恒流泵和收集檢測(cè)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)好流速和收集系統(tǒng)以備下用（控制流速為每滴10秒，收集量為每管3毫升）（3）鹽析法分離提取麥清蛋白粉碎2g小麥種子→置于三角瓶中，加20ml蒸餾水→連續(xù)震蕩0.5h，再間歇震蕩0.5h→3000rmin離心20min，取上清液（澄清透明，否則再過(guò)濾）→用醋酸調(diào)pH至4.7→邊攪拌邊加入等體積的飽和硫酸銨溶液，有白色

7、絮狀沉淀產(chǎn)生，冰箱冷藏室過(guò)夜（充分沉淀麥清蛋白）→3000rmin離心20min，棄上清液，加2ml去離子水充分溶解沉淀，得混合液，準(zhǔn)備上樣脫鹽。（4）上樣在柱內(nèi)放入濾紙片，自然飄落覆蓋（防止上樣時(shí)不溶物侵入柱床和液滴對(duì)床面的沖擊）→用恒流泵加速按鈕使洗脫液面和膠床表面相齊，停止洗脫→將1ml樣品提取液注入凝膠床面中央，開(kāi)啟洗脫和收集器收集→待樣液與凝膠床面相齊時(shí)用滴管加入略高于剛才上樣高度的洗脫液，重復(fù)兩次，（將殘留在壁上的樣品洗入膠