釘螺血藍(lán)蛋白的提取純化與性質(zhì)的初步研究.pdf

1、126保密等級★保密年限保密等級★保密年限單位代碼：單位代碼：10418碩士學(xué)位論文釘螺血藍(lán)蛋白的提取純化與性質(zhì)的初步研究作者姓名張云張云指導(dǎo)教師范小林范小林學(xué)科(專業(yè)專業(yè))有機(jī)化學(xué)有機(jī)化學(xué)所在學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院提交日期2008年5月29日贛南師范學(xué)院碩士學(xué)位論文I摘要釘螺作為日本血吸蟲的唯一中間宿主，它們的分布與血吸蟲流行區(qū)一致。在釘螺血淋巴中負(fù)責(zé)氧運輸?shù)氖且环N細(xì)胞外的大分子蛋白質(zhì)—血藍(lán)蛋白（Hc）。目前，有關(guān)釘

2、螺血藍(lán)蛋白的研究還未見報道，從分子層面上研究釘螺血蘭蛋白，可望為血吸蟲防治新技術(shù)的研發(fā)提供實驗依據(jù)和理論指導(dǎo)。本文系統(tǒng)研究了釘螺血蘭蛋白的提取和純化方法，并對其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了初步探討。本實驗通過超高速冷凍離心和Sepharose4B凝膠過濾柱層析法從湖北釘螺血淋巴中提取、純化了血藍(lán)蛋白。采用紫外吸收光譜法測定了釘螺血藍(lán)蛋白340nm處的特征吸收峰，利用原子吸收光譜法測得其銅含量為0.23％。透射電子顯微鏡研究結(jié)果證實其四級結(jié)構(gòu)為中凹的

3、圓柱體，且以單體、二聚體、多聚體共存于血淋巴中。以SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測其蛋白質(zhì)亞基成分，發(fā)現(xiàn)有2種蛋白質(zhì)亞基成分，與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較，有條位置接近400KDa，一條接近250KDa。大量研究事實表明，軟體動物及節(jié)肢動物的血藍(lán)蛋白與酚氧化酶(PO)雖然功能不同，但在結(jié)構(gòu)上均具有銅氧結(jié)合位點，且在特定的條件下，血藍(lán)蛋白又能轉(zhuǎn)化為酚氧化酶樣酶(HdPO)而表現(xiàn)出PO活性。實驗中利用體外激活劑對釘螺血藍(lán)蛋白的激活結(jié)果顯示，胰肽酶

4、E和尿素能非常有效地將Hc轉(zhuǎn)化為HdPO，0.1%SDS對Hc的激活作用很弱。為此，本研究中選用2M尿素來激活Hc純品使之成為HdPO，并以鄰苯二酚為特異性底物對其HdPO生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，HdPO對鄰苯二酚底物的最適反應(yīng)pH值約為7.0和9.0，最適溫度約為40℃Km值約為2.69mmolL。底物特異性研究還發(fā)現(xiàn)此HdPO不僅對鄰苯二酚具有氧化活性，對酪氨酸底物也具有氧化活性，且對酪氨酸的Km值約為9.52mmol

5、L，說明該酶既具有酪氨酸酶活性，又具有兒茶酚酶活性。此外，HdPO對金屬離子鰲合劑乙二胺四乙酸(EDTA)非常敏感，其酶活性能被EDTA強(qiáng)烈抑制，但Ca2、Mg2、K、Na對酶活性的影響很小。通過ELISA實驗確定釘螺血藍(lán)蛋白與日本血吸蟲具有共同抗原表位，并對ELISA相關(guān)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為血藍(lán)蛋白的免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。最終確定抗原濃度為50ngml；血清稀釋倍數(shù)為1：1000；BSA封閉時間為2h；酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)濃度為1：2